Зниження рівня печінкового лактотрансферину викликає стеатоз печінки при хронічній безалкогольній моделі жирової хвороби печінки

Професор БуХюн Юн

Відділ біологічних наук,

Пусанський національний університет Busandaehak-ro 63 beon-gil,

Geumjeong-gu, 46241 Пусан (Корея)

Тел. 82-51-510-2264, факс 82-51-581-2962, електронна пошта [email protected]

Статті, пов’язані з "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Електронна пошта

Анотація

Вступ

Лактотрансферрин (Ltf) - це залізозв’язуючий глікопротеїн, що виділяється в молоко та інтерстиціальні рідини і, як повідомляється, має різні функції, включаючи протизапальну, -біотичну, -оксидантну, -вірусну та -канцерогенну дії [13]. Крім того, раніше було показано, що введення Ltf зменшує накопичення ліпідів у печінці та полегшує НАЖХП на мишачих моделях [13, 14]. Більшість досліджень ролі Ltf у запобіганні НАЖХП було проведено десять років тому, і було виявлено, що Ltf запобігав НАЖХП, пригнічуючи поглинання хіломікрону [15]. Більше того, у структурному дослідженні пояснили, що Ltf містить багату аргініном область, яка була подібною до місця аполіпопротеїну Е (ApoE), що зв'язується з ліпопротеїновим рецептором низької щільності (LDLr), пов'язаним з LDLr білком 1 (LRP-1) або ліполізом -стимульований ліпопротеїновий рецептор (LSR) [16]. В недавньому дослідженні було підтверджено, що Ltf зв'язується з LSR та інгібує кліренс хіломікрону за допомогою експериментів з блотгандами лігандів [17]. Однак роль експресії Ltf в печінці в регуляції NAFLD та механізм регуляції експресії Ltf все ще не з'ясовані.

Встановлення відповідної моделі тварин є важливим для доклінічних досліджень. У дослідженнях з вивчення механізму розвитку НАЖХП багато в природних умовах Моделі NAFLD були створені за допомогою дієт, що включають дієти з високим вмістом фруктози, жиру та МКД (з дефіцитом метіоніну та холіну), або за допомогою генетичної модифікації, включаючи надмірну експресію SREBP-1c або приглушення PPARα [18]. Підходи до створення нової моделі NAFLD послідовно пропонувались у дослідженнях з метою з'ясування молекулярного механізму NAFLD. Однак моделі зазвичай демонстрували сильне накопичення печінкових ліпідів протягом декількох днів, що занадто коротко, щоб імітувати початковий печінковий стеатоз пацієнтів, навіть враховуючи різницю в масштабі часу у людини та мишей [19]. Оскільки розвиток НАЖХП проводився у пацієнтів протягом декількох місяців, хронічно розвивається модель НАЖХП може показувати під молекулярними подіями печінки гострі моделі. Крім того, використання індукованих дієтою моделей НАЖХП не може визначити рушійну силу НАЖХП, виявлену у пацієнтів без ненормального харчування та генетичних мутацій. Отже, хронічна та незалежна від дієти модель НАЖХП може подолати обмеження існуючих моделей мишей НАЖХП.

У цьому дослідженні ми провели дослідження для виявлення механізму початкового стеатозу печінки шляхом встановлення нової моделі миші NAFLD з опроміненням всього тіла на основі попередніх досліджень. Потім ми проаналізували транскриптомні профілі печінки та продемонстрували молекулярний механізм стеатозу печінки.

Матеріали і методи

Клітинні лінії, культивування та трансфекція

В дослідженні використовували AML12 (нормальна клітинна лінія клітин гепатоцитів), MIHA та HL-7702 (нормальні клітинні лінії гепатоцитів людини). Клітинна лінія AML12 була щедро обдарована проф. Хун-Сік Чой (Національний університет Чоннам, Кванджу, Республіка Корея). Клітинна лінія MIHA була щедро обдарована проф. Сук Ву Нам (Католицький університет Кореї, Сеул, Республіка Корея). Клітинна лінія HL-7702 була щедро обдарована проф. Soon-Sun Hong (Медична школа Університету Інха, Інчхон, Республіка Корея). AML12 вирощували в DMEM/F-12, MIHA вирощували в DMEM, а HL-7702 вирощували в RPMI-1640, що містить 10% FBS, 100 U/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Клітини інкубували у зволоженій атмосфері 95% повітря/5% атмосфери CO2 при 37 ºC.

Перехідна трансфекція була проведена за попереднім дослідженням [25]. Коротко, суміш Lipofectamine TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) та pCMV6-Ltf (Origene Technologies, Rockville, MD) інкубували 30 хв для утворення ліпосом і наносили на клітини MIHA або HL-7702 протягом 12 годин. Після обміну свіжими середовищами клітини використовували для подальших експериментів.

Антитіла та реактиви

Первинні антитіла, специфічні для Ltf, p-Stat5, Stat5, α-тубуліну, були придбані у компанії Santa Cruz Biotechnology (Санта Круз, Каліфорнія). Вторинні антитіла, специфічні для IgG миші, IgG кролика та IgA кози, були придбані у Enzo Life Sciences (Ann Arbor, MI). Гормон росту (ГР) був придбаний у Prospec (East Brunswick, NJ), а куместрол - у Enzo Life Sciences.

Протокол тварин та опромінення

Експерименти на тваринах проводили за попереднім дослідженням [26, 27]. Коротко кажучи, 3-тижневих самців мишей C57BL/6 було придбано у Orient Bio Inc. (Пусан, Республіка Корея). Протоколи тварин були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Національного університету Пусан (Пусан, Республіка Корея) та виконувались відповідно до положень Керівництва NIH з догляду та використання лабораторних тварин. Мишей утримували індивідуально або групами до п’яти осіб у стерильних клітках. Тварин утримували у приміщеннях для догляду за тваринами в кімнаті з регульованою температурою (23 ± 1 ° C) протягом 12-годинного циклу світло/темнота, розподіляючи та рандомізуючи для експериментів техніком закладу, та карантину протягом 1 тижня до вивчення. Тварин годували водою та звичайною дієтою для миші з чау-чаєм. Для експериментів на тваринах для генерування моделі миші NAFLD, спричиненої дієтою, мишей годували дієтою з високим вмістом фруктози (60% фруктози у вазі), високим вмістом жиру (60% калорій з жиру) або дієтою MCD.

Мишей знеболювали перед опроміненням і піддавали одноразовому опроміненню 6 Гр гамма-випромінювання, виробленого екстрактором Gamma Cell 40 (Nordion International Inc., Каната, Онтаріо, Канада). Опромінених мишей інкубували протягом 5 тижнів і інтраперитонеально вводили GH (2 мкг/г · день) або куместрол (0,5 мкг/г · день) згідно з експериментами. Мишей забивали після знеболення, а кров і печінку забирали для аналізу після попереднього дослідження [28]. Кров відбирали з серця, згортали і виділяли сироватку шляхом центрифугування (1500 г, 15 хв). Сироватка заморожувалась при -70 ºC до подальших експериментів. Печінку розрізали товщиною 4 мм і замочували в суміші оптимальної температури різання (OCT) (Sakura Finetek, Токіо, Японія) для гістологічного аналізу. Залишені зразки печінки безпосередньо заморожували у рідкому азоті, зберігали при -70 ºC до подальших експериментів.

Гістологічний аналіз

Гістологічний аналіз проводили, як описано в попередньому дослідженні [29]. Заморожений блок печінки розрізали на товщину 8 мкм за допомогою кріостатів (Leica Biosystems, Буффало Гай, штат Іллінойс), сушили при кімнатній температурі протягом 1 години і зберігали при -20 ºC. Для фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) предметні стекла фіксували у розчині формаліну протягом 10 хв при RT і промивали в TBS (50 мМ Tris-Cl, 150 мМ NaCl, рН 7,6) протягом 5 хв двічі. Слайди інкубували в розчині гематоксиліну (Muto Pure Chemicals, Токіо, Японія) протягом 3 хв, промивали в дистильованій воді (DW) і забарвлювали в 1% HCl 70% EtOH. Потім предметні стекла переміщали в розчин еозину (Muto Pure Chemicals) та інкубували протягом 5 хв і тричі промивали в DW. Згодом зневоднення проводили шляхом послідовного інкубування в 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH та ксилолі. Слайди були змонтовані в розчині Permount Mounting (Fisher Scientific, Пітсбург, Пенсільванія). Забруднені предметні стекла візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопа Olympus IX71 (Olympus Optical Co. Ltd.).

Для фарбування олійно-червоним O (ORO) предметні стекла фіксували у формаліні та двічі промивали в TBS. Вихідний розчин ORO (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) розбавляли 3: 2 DW для отримання робочого розчину ORO. Слайди інкубували в робочому розчині ORO протягом 15 хв, промивали DW. Склади фарбували в розчині гематоксиліну протягом 3 хв, промивали, зневоднювали і встановлювали, як описано вище.

Для фарбування червоним кольором Сіріуса предметні стекла фіксували у формаліні та двічі промивали в DW. Потім предметні стекла інкубували у фарбувальному розчині Sirius red (0,1% Direct Red 80 (Sigma Aldrich), розчиненому в пікриновій кислоті) протягом 60 хв. Потім предметні стекла двічі промивали 0,5% оцтовою кислотою, зневоднювали і встановлювали, як описано вище.

Аналіз тригліцеридів (TG)

Оцінку вмісту тригліцеридів у тканині печінки або гепатоцитах проводили за набором для аналізу TG (BioVision, Milpitas, CA). Для виділення вмісту ліпідів тканини печінки та клітини гомогенізували та лізували у 5% розчині NP-40 у DW. Лізати кип'ятили в тепловому блоці при 80 ºC протягом 5 хв і охолоджували при кімнатній температурі протягом 10 хв. Цю процедуру повторювали двічі. Потім зразки центрифугували при 13 000 об/хв протягом 2 хв і отримували супернатант. Оцінку вмісту TG проводили відповідно до вказівок виробника, а результати вимірювали за допомогою зчитувача GloMax® Multi Microplate (Promega, Madison, WI). Для нормалізації TG у зразках печінки вміст білка в супернатанті визначали кількісно за допомогою набору для аналізу білків BioRad (BioRad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія) після попереднього дослідження [30].

Профілювання експресії генів та аналіз даних

Транскриптомічний аналіз проводили за попереднім дослідженням [31]. Коротко, загальну РНК виділяли з тканини печінки за допомогою RNeasy® (Invitrogen, Carlsbad, CA) та кваліфікували за допомогою спектрофотометра Nanodrop-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). РНК була перетворена у дволанцюжковий шаблон кДНК методом IVT (транскрипція in vitro), очищена за допомогою модуля очищення зразків Affymetrix та фрагментована за допомогою ендонуклеази рестрикції. Фрагментована кДНК була кінцево мічена біотінільованим дидеоксинуклеотидом та гібридизована до масивів GeneChip® Mouse Gene 2.0 ST. Дані були нормалізовані за допомогою алгоритму міцного багаторівневого середнього (RMA), реалізованого в програмному забезпеченні Affymetrix Expression Console (версія 1.3.1.) (Http://www.affymetrix.com), і розподіл сигналів порівнювали за допомогою побудови графіків за допомогою отриманих інструментів з проекту «Біопровідник» (http://www.bioconductor.org). Були відібрані диференціально експресовані гени (DEG)> 1,5-кратні середні різниці сигналів між контрольною та обробленою групами. Теплова карта була зображена за допомогою ієрархічного методу кластеризації. Результат мікрочипів був депонований у GEO (номер приєднання GSE103622).

Напівкількісна RT-PCR

Для оцінки рівня мРНК у клітині та тканині було проведено напівкількісну RT-PCR за попереднім дослідженням [32]. Загальну РНК, вилучену з тканини печінки або гепатоцитів, перетворювали в кДНК за допомогою набору синтезу кДНК SuperScript® VILO та основної суміші (Invitrogen, Carlsbad, CA). CDNA ампліфікували, використовуючи Taq-полімеразу (Takara Bio Inc., Токіо, Японія), дотримуючись інструкцій виробника з адекватними праймерами. Послідовності праймерів, використані для експериментів, були перелічені нижче. Миша Gapdh F: GGT GAA GGT CGG TGT GAA CGG ATT R: GAT GCC AAA GTT GTC ATG GAT GAC C Миша Ltf F: CGA AGC ACG AAT GAC AAA GA R: ACA AAG CCA ATG GCA GAC TC Людина GAPDH F: ATG ACA AGA AGG TGG TG R: CAT ACC AGG AAA TGA GCT TG Людина LTF F: GAG AAG GAG TGT TCA GTG GT R: ATA GTG AGT TCG TGG CTG TC

Вестерн-блот-аналіз

Вестерн-блот-аналіз проводили, як описано раніше [33]. Для одержання зразка білка тканину або клітини гомогенізували та лізували в аналізі радіоімунопреципітаційного (RIPA) буфера лізису (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,4, 1% Triton X-100, 25 мМ NaF, 1 мМ дитиотрейтолу (DTT) ), 20 мМ EGTA, 1 мМ NA3VO4, 0,3 мМ фенілметансульфонілфториду (PMSF) і 5 од/мл апротиніну). Потім лізати центрифугували при 13000 об/хв при 4 ° С протягом 15 хв. Одержали супернатант і вимірювали концентрацію загального білка за допомогою набору для аналізу білків BioRad (BioRad Laboratories). 40 мкг зразків білка завантажували в SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрани блокували в 5% BSA в TBST (10 мМ Трис, 100 мМ NaCl і 0,1% Твін 20) протягом 1 години при КТ і інкубували з первинними антитілами протягом ночі при 4 ° С. Згодом мембрани промивали в TBST і зондували вторинними антитілами протягом 1 години при RT та застосовували систему виявлення ECL (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) для виявлення.

Імуноферментний аналіз (ІФА)

Для оцінки рівнів ГР у сироватці крові, виділену з крові, використовували в ІФА після попереднього дослідження [34]. Отриману кров інкубували 15 хвилин при КТ для згортання і центрифугували для виділення згустків. Сироватку супернатанту отримували і застосовували для ІФА. ІФА проводили за допомогою набору GH ELISA (USCN Life Science Inc., Х'юстон, Техас) згідно інструкцій виробника.

Імунофлюоресценція (ІФ)

Для оцінки субклітинної локалізації Stat5 IF проводили за попереднім дослідженням [35]. Коротко кажучи, клітини висівали в предметне скло, обробляли GH протягом 30 хв і фіксували крижаним ацетоном протягом 20 хв при -20 ºC. Потім клітини блокували 1% BSA в PBS протягом 1 години при RT і інкубували з первинними антитілами протягом ночі при 4 ºC. Потім клітини промивали і зондували кон'югованими вторинними антитілами DyLight® 488 (Thermo Fisher Scientific) та візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопа Olympus IX71.

Виділення та лікування ліпопротеїнів, багатих на TG

Плазму людини для досліджень було придбано у Корейського Червоного Хреста (Пусан, Республіка Корея). Щоб отримати багатий TG ліпопротеїн із сироватки людини або миші, ми провели виділення багатих TG ліпопротеїнів після попереднього дослідження [36]. Ми виділили сироватку в поліалломерну пробірку (Бекман Коултер, Пасадена, Каліфорнія) і помістили такий же об'єм NaCl (d= 1,006г/мл) розчину на сироватці. Пробірку центрифугували ультрацентрифугою (Beckman) з ротором SW 40 (Beckman) при 40 000 об/хв протягом 24 годин при 4 ºC. Після центрифугування отримували верхні 10% загального обсягу і вміст TG вимірювали за допомогою набору для аналізу TG, як описано вище. Крім того, багатий TG зразок ліпопротеїну змішували з буфером зразків SDS і завантажували в SDS-PAGE для фарбування сріблом. Для експериментів з оцінки ефекту багатого TG ліпопротеїну в Росії в пробірці моделі, багатий TG ліпопротеїн обробляли концентрацією TG 0,2 мг/мл протягом 24 годин, а накопичення TG спостерігали за допомогою фарбування ORO або аналізу TG.

Фарбування сріблом

Для підтвердження виділення багатого TG ліпопротеїну із сироватки та порівняння кількості багатого TG ліпопротеїну в сироватці миші ми провели SDS-PAGE та фарбування сріблом, як було описано в попередньому дослідженні [37]. Набір Pierce TM Silver Stain Kit (Thermo Scientific) застосовувався відповідно до інструкцій виробника. Коротше кажучи, виділений багатий TG ліпопротеїн змішували з буфером зразків SDS і завантажували в SDS-PAGE. Гелі закріплювали протягом 30 хв і двічі промивали DW. Сенсибілізуючий розчин наносили на гель на 15 хв і фарбували розчином нітрату срібла. Потім гель переміщали до розчину, що розвивається, протягом 5 хв. Розробку зупинили, промили та відсканували.

Статистичний аналіз

Всі числові дані представлені як середнє значення ± стандартна помилка (SEM) принаймні трьох незалежних експериментів, а обсяги вибірки розраховані, щоб забезпечити значущість. Експериментальні результати аналізували за допомогою одностороннього дослідження ANOVA, після чого проводився чесно значущий різничний тест Тукі або t-тест Стьюдента. Для проведення статистичного аналізу було використано програмне забезпечення Prism 5 (GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія), і статистична значимість була прийнята для стор-значення експресії в 1,5 рази були зображені на тепловій карті (271 ген був регульований вгору і 184 гени були регульований вниз). Гени були переставлені за допомогою ієрархічної кластеризації. Положення Ltf на тепловій карті було позначено стрілкою. (B) Рівні експресії печінки мРНК Ltf у мишей оцінювали за допомогою напівкількісної RT-PCR. Експресія мРНК була визначена кількісно з трьох незалежних експериментів. Середнє значення ± SEM. *, стор