Заглушення білка-транспортера жирної кислоти печінки 5 у природних умовах відміняє індуковану дієтою безалкогольну хворобу жирової печінки та покращує гіперглікемію * S⃞

Холгер Додж

‡ Науково-дослідний інститут Медичного фонду Пало-Альто, Пало-Альто, Каліфорнія, 94301, Медичний факультет, § Кафедра ГІ/Гепатологія та ¶ Відділи педіатрії та генетики Стенфордського університету, Стенфорд, Каліфорнія 94305, і ∥ Відділ харчових наук та токсикології, Каліфорнійський університет, Берклі, Берклі, Каліфорнія 94720

Дірк Грімм

Сокол-аларик

Берніс Цанг

Тереза А. Буря

Хуей Сюй

Анжеліка М. Ортегон

Меліса Казанціс

Марк А. Кей

‡ Науково-дослідний інститут Медичного фонду Пало-Альто, Пало-Альто, Каліфорнія, 94301, Медичний факультет, § Кафедра ГІ/Гепатологія та ¶ Департаменти педіатрії та генетики, Стенфордський університет, Стенфорд, Каліфорнія 94305, і ∥ Департамент харчових наук та токсикології, Каліфорнійський університет, Берклі, Берклі, Каліфорнія 94720

Андреас Шталь

Пов’язані дані

Анотація

Безалкогольна жирова хвороба печінки - це серйозна проблема здоров’я, пов’язана з ожирінням та діабетом 2 типу. Щоб дослідити біологічний результат та терапевтичний потенціал пригнічення поглинання жирних кислот у печінці, ми застосували аденоасоційовану вірусно-опосередковану методику втручання РНК, щоб збити експресію транспортного білка 5 печінкової жирної кислоти in vivo до або після встановлення неалкогольної жирної захворювання печінки у мишей. Використовуючи цей підхід, ми демонструємо тут здатність досягти специфічного, нетоксичного та стійкого збиття транспортного білка 5 жирних кислот у печінці миші за одну ін’єкцію аденоасоційованого вірусу, що призводить до помітного зменшення споживання жирних кислот у печінці, зменшення споживання калорій та супутній захист від індукованої дієтою неалкогольної жирової хвороби печінки. Важливо те, що знищення білка транспорту жирних кислот 5 також змогло змінити вже встановлену безалкогольну жирову хворобу печінки, що призвело до суттєвого поліпшення гомеостазу глюкози у всьому тілі. Таким чином, для підтримки засвоєння калорій та надходження жирних кислот у печінку під час годування з високим вмістом жиру необхідна безперервна активність транспортного білка 5 печінкової жирної кислоти, що може створити новий шлях для лікування неалкогольної жирної хвороби печінки.

В даний час загальносвітова поширеність безалкогольної жирової хвороби печінки (НАЖХП) 2 зараз оцінюється у 30% загальної популяції і вражає більшість пацієнтів із ожирінням та діабетом 2 типу (1, 2). У людей із ожирінням хронічно підвищений вміст вільних жирних кислот у сироватці крові (FFA) і високий рівень інсуліну призводять як до збільшення поглинання FFA печінкою, так і до збільшення синтезу ліпідів, що призводить до накопичення печінкових тригліцеридів (TG), як правило, супроводжується десенсибілізацією печінкового інсуліну (1, 3) із залученням протеїнкінази C ε (3). Сучасні стратегії фармакологічного лікування НАЖХП зосереджені головним чином на збільшенні окислення печінкової жирної кислоти (4) та поліпшенні чутливості до позапечінкового інсуліну (5). Однак жоден із цих методів лікування не зменшує печінкове засвоєння харчових жирів, і нові терапевтичні засоби, які спеціально спрямовані на скасування НАЖХП в контексті ожиріння, були б дуже бажаними.

Виходячи з передумов, що асоційоване з ожирінням НАФЛД в основному зумовлене безперервним поглинанням білками жирних кислот печінкою і що НАЖХП є фактором, що сприяє десенсибілізації інсуліну у всьому організмі, ми стверджували, що блокування білків, відповідальних за засвоєння жирних кислот печінкою повинен запобігати або зворотний стеатоз печінки, покращуючи таким чином чутливість до інсуліну та гомеостаз глюкози. Два представники сімейства транспортних білків жирних кислот (FATP), FATP2 та FATP5, сильно експресуються в печінці (6) і, як вважають, беруть участь у ранніх етапах поглинання/активації довголанцюгових жирних кислот (7, 8). Нещодавно ми продемонстрували важливість FATP5 у метаболізмі ліпідів у печінці, показавши, що видалення FATP5 частково захищало мишей від розвитку ожиріння, спричиненого дієтою, та покращення чутливості до інсуліну (9, 10).

Для вивчення наслідків абляції печінкової FATP5 в контексті NAFLD для поглинання жирних кислот печінкою та потоків ліпідів у всьому тілі ми скористалися нещодавно розробленою 8-опосередкованою доставкою стабілізованого дволанцюжкового (sds) аденоасоційованого вірусу (AAV). метод експресії РНК малого шпильки (sh), спрямований на печінку (11). Використовуючи цей підхід, ми могли б досягти специфічного мовчання ендогенного FATP5 у мишей після одноразової доставки конструкцій експресії sdsAAV-shRNA, що призводило до захисту/зворотного розвитку НАЖХП та гіперглікемії у мишей із ожирінням, спричинених дієтою.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Антитіла та реактиви - жирна кислота BODIPY (C1-BODIPY-C12) була отримана з молекулярних зондів (Eugene, OR). [14 С] Олеїнова кислота була придбана у ARC, Inc. (Сент-Луїс, Міссурі). Поліклональні антисиворотки проти С-кінців FATP2, -4 та -5 були підняті, як описано раніше (9, 12). Анти-β-тубулінові та антиінсулінодеградуючі ферментні антитіла були придбані у BD Biosciences та BD Transduction Laboratories, відповідно. Імуноблот-аналіз проводили, як повідомлялося раніше (13). Всі інші хімічні речовини були отримані від Sigma.

Конструкції AAV-shRNA - олігонуклеотиди проти FATP5 були розроблені, як запропоновано (14), і не мали жодної значущої гомології з іншими генами в геномі миші. Всі шРНК, що використовувались in vitro, експресувались з людського промотору H1 (конструкція експресії на основі pSUPERIOR; OligoEngine, Сіетл, Вашингтон). Послідовність циклу була 5′-TTCAAGAGA-3 ′. Стабілізовані дволанцюгові (sds) вектори AAV для стійкої та ефективної експресії shRNA у печінці були отримані з елементів серотипів AAV 2, 4 та 8 (11). Вірусні частинки генерували, очищали та титрували, як описано Grimm et al. (15).

Аналіз поглинання жирної кислоти в клітинах HEK293 - Аналіз поглинання жирних кислот проводили, як описано раніше (12).

Загальні процедури для тварин - мишей C57BL/6 або швейцарських вебстерів купували у лабораторії Джексона (Бар-Харбор, Міссісіпі) та акліматизували протягом 1 тижня після прибуття, перш ніж використовувати для експериментів. Тварин утримували на регулярному лабораторному чау (5P75, LabDiet, Richmond, IN) або на спеціальній дієті (див. Нижче), отримуючи їжу та воду за бажанням, і утримували при 22 ° C при 12-годинному/12-годинному освітленні/темний цикл. Мишей-нокаутів FATP5 генерували та підтримували, як описано раніше (9). Усі досліджувані групи мали порівнянний початковий вік та вагу. Внутрішньовенне введення sdsAAV8 (5 × 10 10 або 3 × 10 11 вірусних частинок (в.п.), загальний об’єм 250 мкл у PBS) здійснювали за допомогою ін’єкцій у хвостову вену за встановленими методами (16). Для досліджень дієти окремо утримуваних 8-тижневих мишей-самців годували за бажанням дієту з високим вмістом жиру, що містить 60% жиру (D12492, Research Diets, NJ), або дієту з низьким вмістом жиру (> D12450), що містить 10% жиру. Вагу вимірювали щотижня, а споживання їжі вимірювали два рази на тиждень. Стандартні тести на толерантність до глюкози та інсуліну, а також вимірювання ліпідів проводили, як описано раніше (17). Усі процедури були затверджені Комітетом з догляду за тваринами в Дослідницькому інституті Медичного фонду Пало Альто та Інституційним комітетом з догляду та використання тварин в Каліфорнійському університеті.

Підготовка гепатоцитів. Печінка миші була канюльована через ворітну вену і зроблений розріз у нижній порожнистій вені. Перфузію печінки з травленням та перфузійними середовищами та виділення гепатоцитів проводили згідно з інструкціями виробника (Invitrogen) з подальшим аналізом засвоєння довголанцюгових жирних кислот, як описано (9).

Аналіз ліпідів тканин - зразки з різних тканин подрібнювали у рідкому азоті, а загальні ліпіди екстрагували методом Folch et al. (18). Загальний вміст тригліцеридів аналізували за допомогою колориметричного набору (Sigma Diagnostics).

Морфологія печінки - кріосекції, отримані з печінки нокаутованих або нокаутованих тварин FATP, та відповідні контролі фарбували або трихромним реагентом Массона, або гематоксиліном та еозином. Нейтральні краплі ліпідів фарбували BODIPY 493/503 (молекулярні зонди).

Статистичний аналіз. Статистичний аналіз нокауду FATP5 або нокауту FATP5 у порівнянні з шифрованим контролем (SCR) або контролями дикого типу проводився за допомогою критерію Стьюдента або аналізу дисперсійного тесту, якщо це доречно. S.E. відображаються значення. p Рис. 1A) та імуноблоти (Fig. 1B) відповідно. В обох аналізах було виявлено дві конструкції (FATP5-2, FATP5-3), здатні викликати стійкий ефект інтерференції РНК. Ми не спостерігали жодного ефекту для інших конструкцій shRNA або контролю SCR у порівнянні з клітинами, трансфікованими лише відповідними векторами експресії FATP.

Нокдаун FATP2 та FATP5 in vitro та in vivo. A, клітини HEK293 ко-трансфікували порожнім вектором експресії (чорна смужка) або експресійними плазмідами FATP5 (біла смужка) або в поєднанні із зазначеними конструкціями shRNA. Поглинання флуоресцентної жирної кислоти (FA) (C1-BODIPY-C12) визначали через 2 дні після трансфекції за допомогою проточної цитометрії. Середня флуоресценція, нормалізована до порожнього вектора. Полоски помилок вказують на стандартне відхилення. B, Вестерн-блот-аналіз клітинних лізатів від ко-трансфекції. α-тубулін служив контролем завантаження. ІБ, імуноблот. C, Вестерн-блот-аналіз опосередкованого sdsAAV-shRNA нокдауну білка FATP5 in vivo. Білки екстрагували з гомогенатів тканин печінки різних штамів мишей (C57BL/6 та Swiss Webster) через 4 тижні після ін’єкції із зазначеними конструкціями та титрами вірусів та досліджували антисироватками, специфічними для FATP5, FATP2, FATP4 та ферменту, що розкладає інсулін. АВ, антитіло. D, поглинання жирних кислот гепатоцитами, виділеними через 4 тижні після ін’єкції вірусу. Поглинання FFA визначали ex vivo за допомогою аналізу поглинання флуоресцентних жирних кислот.

Втрата печінкових FATP перенаправляє дієтичні ліпідні потоки - для характеристики змін у кліренсі ліпідів після їжі у мишей AAVSCR та AAVFATP5 ми провели манометри, що містять індикатор олеату [14 C], після нічного голодування, використовуючи мишей C57BL/6, яких годували нормальним чаєм ai Початкова поява 14 С у сироватці крові була порівнянна серед усіх груп (рис. 2А), що свідчило про нормальне всмоктування у всіх тварин. Однак кількість 14C (рис. 2А), а також вміст TG та FFA у сироватці крові (дані не наведені) протягом тривалого періоду були підвищені у групі нокдауну FATP5, натякаючи на порушення кліренсу ліпідів із кровообігу, імовірно через втрату функції печінки FATP. Через чотири години після пробірки ми виявили знижене всмоктування печінкою тварин з нокдауном FATP5 з посиленим відкладенням ліпідів у серці, скелетних м'язах та жирі (рис. 2B). Ці дані узгоджуються із спостережуваними змінами загального вмісту TG у печінці після хронічного годування з високим вмістом жиру (див. Рис. 4B) і свідчать про те, що втрата печінкових FATP викликає перенаправлення ліпідів від печінки до тканин, що спираються на інші паралоги FATP, такі як FATP6, -1 та -4. У сукупності ці висновки міцно підтверджують уявлення про те, що FATP5 відіграє вирішальну роль у засвоєнні жирних кислот печінкою та у розподілі ліпідів після їжі.

Вплив нокдауну FATP на потоки ліпідів після їжі. Через чотири тижні після вірусної трансдукції мишам давали 250 мкл оливкової олії з додаванням 3,5 мкКі [14 C] олеїнової кислоти. Кількість А, 14 С визначали у зразках сироватки, відібраних через 0, 30, 60, 120 та 240 хв після пробірки. B, через 240 хв після гемографії, мишей евтаназували і визначали показники 14 C, нормалізовані до вмісту білка, для печінки, серця, скелетних м’язів (Sk.M.), білої жирової тканини (WAT) та лізатів нирок. Полоски помилок вказують на стандартне відхилення, а зірочки вказують на p Рис. 3, A і B). Хоча печінка контрольних мишей, що вводили PBS та AAVSCR, демонструвала типові характеристики макросудинного стеатозу, як миші, яким вводили AAVFATP5, так і миші FATP5KO (9, 10) демонстрували значний захист із помітним зменшенням інфільтрації ліпідів (рис. 3C) та значним зменшенням загальний вміст TG в печінці (AAVSCR, 35,4 ± 1,1 мкмоль/г; FATP5KO, 21,9 ± 4,2 мкмоль/г). Підводячи підсумок, ці результати демонструють, що одиночна sdsAAV-опосередкована доставка експресійних конструкцій shRNA призводить до фенотипів, які є дуже порівнянними з генетично інженерними нокаутованими тваринами, і що опосередкована AAV втрата FATP5 захищає тварин від розвитку індукованої дієтою печінковий стеатоз.

У сукупності ми зробили три важливі зауваження. По-перше, ми демонструємо, що опосередкована AAV експресія шРНК є ефективним інструментом для придушення печінкових генів у нормальній та стеатотичній печінці. Це є важливою знахідкою, оскільки це перший звіт про нетоксичну, специфічну для печінки трансдукцію та індукцію інтерференції РНК із використанням стабілізованих дволанцюжкових частинок AAV серотипу 8 і повинен дозволити майбутнім експериментам розбирати молекулярні компоненти, що лежать в основі печінкових ліпідних потоків, під фізіологічним та патофізіологічні стани. По-друге, ми показуємо, що опосередкований AAV збій FATP5 захищає від індукованого дієтою стеатозу печінки з високим вмістом жиру та перенаправляє потоки ліпідів після прийому їжі далеко від печінки. Нарешті, придушення FATP5 достатньо, щоб змінити встановлену НАЖХП у нашій моделі ожиріння, спричиненої дієтою, та поліпшити гомеостаз глюкози у всьому тілі. Таким чином, зменшення печінкових FATP або за допомогою генної терапії, або за допомогою малих молекулярних інгібіторів є новим інструментом для динамічного перенаправлення ліпідних потоків і може забезпечити нові підходи до лікування НАЖХП та резистентності до інсуліну.

Додатковий матеріал

Подяка

Ми дякуємо Джону Малхолланду, Кітті Лі, Корін Девіс та Різ Засіо зі Стенфордського університету. Ми вдячні за допомогу, отриману від співробітників дослідницького інституту Медичного фонду Пало Альто.