Вплив солі на гіпертонію та окислювальний стрес на щурячій моделі ожиріння, спричиненого дієтою

Департамент фізіологічних наук, медична школа Східної Вірджинії, Норфолк, Вірджинія 23507

Анотація

Тварини

Усі процедури за участю тварин були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Східної Вірджинії. Вісімнадцять самців щурів SD (300–350 г), що знаходились в клітці в окремі клітини, були випадковим чином обрані для годування дієтою з помірним вмістом жиру (MHF) з 0,8% натрію (32% ккал у жирі, Research Diets, New Brunswick, NJ), тоді як шість щурів (контролі) годували очищеною дієтою з низьким вмістом жиру (LF) з 0,8% натрію (10,6% ккал як жир, Дієти досліджень) протягом 10 тижнів. Ідентичну кількість щурів поміщали на дієти MHF та LF, кожна з яких містила або 2, або 4% натрію (дієти з високим вмістом солі). Продовольство та вода забезпечувались за бажанням протягом усього експерименту. Вага тіла та довжина тіла вимірювались спочатку, а потім щотижня разом із споживанням їжі. Щури, котрі годували МХФ дієтою як з низьким, так і з високим вмістом солі, розділялись на окремі групи на основі приросту BW. Віднесення щурів до рівня ожиріння (OP) (n = 8) та стійкий до ожиріння (АБО) (n = 8) групи проводили, як описано раніше (12).

Систолічний АТ

Початок та розвиток гіпертонії оцінювали за допомогою методу хвостової манжети за допомогою електро-сфігноманометра Narco Biosystems (Х'юстон, Техас). АТ вимірювали в свідомих умовах на початку експерименту та на 1, 5, 8 та 10 тижнів дієти. Для кожного вимірювання реєстрували середнє значення п'яти показань тиску.

Оцінка окисного стресу

Продукцію супероксидних аніонів вимірювали в ізольованих аортальних кільцях за допомогою методу, описаного раніше (12, 21). Коротко, 5-мм аортальні кільця попередньо інкубували в буфері Кребса-бікарбонату при 37 ° C протягом 30 хв, а потім переносили в коктейль, що містить 5 мкмоль/л люцигеніну, і негайно вимірювали кожні 2 хв протягом 15 хв, використовуючи сцинтиляційний лічильник, встановлений у режимі випадковості. Показники були побудовані в графіку та інтегрована площа під кривою. Результати нормалізували на міліграм ДНК, виміряні за допомогою барвника Hoechst 33258, як описано (27). Специфічність реакції перевіряли на здатність 50 Од/мл СОД гасити хемілюмінесценцію в кінці вимірювання.

Вільний 8-ізопростан F2α. Ізопростани вимірювали за допомогою ОВН за допомогою набору від Cayman Chemicals, як описано раніше (12). Сеча, зібрана в метаболічних клітинах протягом 24-годинного періоду, була доповнена 0,05% бутильованим гідрокситолуолом і додана 8- [3 H] ізопростану. Зразки (1 мл) пропускали на споріднену колону (Cayman Chemicals), і лише вільні ізопростани елюювали з використанням 95% метанолу. Елюат випарювали насухо під потоком N2 і гранулу ресуспендували в 1-мл пробному буфері. Кожен зразок аналізували у двох примірниках у двох різних розведеннях та коригували на індивідуальне відновлення 8- [3 H] ізопростану, і результати усереднювали. Нітрат/нітрит аналізували як у плазмі, так і в сечі (розведений 1:50 у PBS) за допомогою колориметричного методу LDH з набором від Cayman Chemicals.

Імуногістохімія для 4-гідрокси-2-ноненалу. Нирки фіксували у 10% забуференному формаліні протягом 3 год і вкладали парафін. Зрізи інкубували з поліклональними антитілами, що розпізнавали аддукти Cys, His, Lys-4 гідрокси-2-ноненального “Майкла” (Calbiochem, розведення 1: 750). Потім предметні стекла реагували з біотинільованими вторинними козячими анти-кролячими антитілами (розведення 1: 500; Vector Laboratories, Burlin-game, CA), з реагентом ABC-Elite avidin (Vector Laboratories) і, нарешті, з DAB Imhano Pure Metal Enhanced DAB Набір основи (Пірс, Рокфорд, Іллінойс).

Гіпертрофія судин та склероз нирок

Площа стінки аорти. Тонкі зрізи вкладеної в парафін тканини фарбували протягом 1 хв толуїдиновим синім та аналізували, як описано раніше (10).

Гістологія нирок. Нирки фіксували у 10% забуференному формаліні протягом 4 год і закладали у парафін. Зрізи фарбували за допомогою реактиву періодичної кислоти-Шиффа (PAS) і фарбували гематоксиліном. Щоб оцінити ступінь сегментарного склерозу, троє незалежних дослідників досліджували слайди сліпо, змішуючи слайди після покриття номерів протоколів. У кожному випадку 80-100 клубочків досліджували для кожного предметного стекла та індивідуально оцінювали за шкалою від 0 до 2+ відповідно до ступеня склерозу клубочків. 0 клас був нормальним на вигляд клубочком; клас 1+ характеризувався м’яким розширенням мезангіального матриксу, відсутністю оклюзії в капілярах клубочків або прилипання до капсули Боумена; і клас 2+ включало розширення мезангіального матриксу, зазвичай фокального з адгезією до капсули Боумена та певним ступенем закупорки капілярів. Оцінка, що представляє суму оцінок, була отримана для кожного щура.

Морфометрія адипоцитів

Жирові тканини з того ж депо та групи об’єднувались і колагеназа перетравлювалась згідно з Родбеллом та Крішною (39). Адипоцити промивали кілька разів для видалення колагенази і центрифугували, щоб відокремити адипоцити від преадипоцитів, стромальних клітин та судинних мембран. Діаметр клітини,200 1200 клітин вимірювали за допомогою системи аналізу зображення 1 (Universal Image, West Chester, PA). Середній діаметр клітини використовували для оцінки середнього об'єму клітини. Розмір клітини (мкг ліпід/клітина) розраховували множенням об'єму клітини (пл) на щільність ліпідів (~ 0,915 г/мл). Вміст клітинних ліпідів визначали за методикою Доула (14). Вміст клітинних ліпідів і розмір клітин використовували для обчислення кількості клітин.

Статистика

Дані є середніми ± SE. Для визначення значущості між різними групами проводили двосторонній або тристоронній ANOVA з подальшим пост-хок-тестом Тукі. P

Таблиця 1. BW та ожиріння у щурів OP, OR та C на дієтах 0,8, 2 та 4% NaCl

Дані представлені як середні значення ± SE; n = 6 щурів/група. Індекс ожиріння розраховували шляхом ділення кубічного кореня ваги тіла (BW; g) на довжину носоанального отвору (мм) × 104. * Значне проти стійкості до ожиріння (АБО) та контролю (С). OP, схильність до ожиріння (P

Рис. 1.Середнє щоденне споживання їжі в групах, схильних до ожиріння (OP), стійких до ожиріння (OR) та контрольних (C) групах з 2% NaCl (A) і 4% NaCl (B) порівняно з 0,8% групами NaCl. Споживання їжі вимірювали щотижня та коригували на витік для кожного щура. Середня кількість на день була побудована для тижня, коли також вимірювали систолічний артеріальний тиск. * Значне порівняно з АБО в тій же групі солі (P

Таблиця 2. Вплив солі на параметри адипоцитів та продукцію лептину у щурів OP, OR та C

Дані є середніми значеннями ± SE для 3-4 щурів/група для морфометрії адипоцитів та n = 6 щурів/група для даних лептину. Діаметр клітини ≈ 1200 клітин (≈200 клітин · жирова подушка -1 · щур -1) вимірювали та використовували для обчислення об’єму та розміру клітини; вміст ліпідів у клітинах використовували для розрахунку кількості клітин. Середній діаметр клітини використовували для оцінки середнього об'єму клітини. Розмір клітини (мкг ліпід/клітина) обчислювали множенням об'єму клітини (пл) на щільність ліпідів (≈0,915 г/мл). н.д., не визначено. * Значний порівняно з 0,8% NaCl. † Значний порівняно з АБО. ‡ Значний порівняно з C. Всі P

Рис.2.Систолічний артеріальний тиск (АТ) в OP, OR та C на 2% NaCl (A) і 4% NaCl (B) порівняно з 0,8% дієтами NaCl. Систолічний АТ контролювали з самого початку дослідження, використовуючи метод хвостової манжети. OP щури з високим вмістом солі значно збільшили АТ, починаючи з тиждень 5, тоді як щури OP на звичайній солі гіпертонічні, починаючи з тиждень 8 на дієті. Активність реніну в плазмі (C.) вимірювали у кінцевих зразках плазми щурів OP, OR та C на 0,8% NaCl, 2% NaCl та 4% NaCl, використовуючи метод RIA. Дані представляють середнє значення ± SE 6 щурів/група. * Значний порівняно з групами АБО і С; # незначний порівняно з аналогом на 2% солі; * значне порівняно з аналогом на 4% солі (P

Окислювальний стрес у звичайних та високосолених дієтах, що харчуються щурами

Рис.3.Вільні ізопростати сечі (A), генерація супероксиду аорти (B), а також виведення нітратів/нітритів (C.) у щурів OP, OR та C на дієтах 0,8% NaCl, 2% NaCl та 4% NaCl. Вільні ізопростани в сечі вимірювали методом ЕІА. В обох групах ОП на дієті з високим вмістом Na і регулярного вживання Na, ізопростани значно підвищені порівняно з відповідними групами OR або C. Вироблення супероксидних аніонів кільцями аорти вимірювали хемілюмінесценцією люцигеніну, як описано в методах. Прийом високого вмісту Na викликає збільшення вироблення супероксиду в групі OP, але не в OR або C. Екскреція нітратів/нітритів, виміряна колориметричним методом LDH, свідчить про приблизно чотирикратне зменшення щурів OP як на звичайних, так і на високосолених дієти, порівняно з групами ОР та С. Вживання солі додатково не зменшує виведення нітратів/нітритів. * Значний порівняно з АБО та С; #значущо проти 2% аналога NaCl; * значний проти 4% аналога NaCl (P

Рис.4.Періодичне фарбування кислотою-Шиффом (PAS) -гематоксиліном фарбування кори нирок у високосольовій ОП (A), АБО (B) і C (C.) щури та нормальна сіль OP (D), АБО (Е) і C (F) щури. Імуногістохімія з використанням 2-гідрокси-4-ноненального (HNE) антитіла в 4% NaCl OP (G), АБО (H) і C (Я) щури та нормальні (0,8%) - сіль OP (J), АБО (К) і C (L) щури; методу контролю з використанням неімунної сироватки замість первинного антитіла (М). Фарбування PAS вказує на гломерулосклероз та посилення відкладення матриксу в корі щурів OP на високосолених (A) і в меншій мірі у щурів OP на регулярній сольовій дієті. Крім того, фарбування HNE є більш інтенсивним у щурів OP, OR та C на високій солі (G-Я) проти нормальної солі (J-L), з однаковою схемою розподілу. Бар = 10 мкм.

Вплив солі на гіпертрофію судин, склероз нирок та видільну функцію

Рис.5.Гіпертрофія судин (A) та виведення альбуміну (B) у щурів OP, OR та C на нормальній (0,8%) та високій (2 та 4%) - сольовій дієті. Площа стіни (A) вимірювали на зрізах аорти, забарвлених толуїдиновим синім, із застосуванням системи відеозаписів на основі програмного забезпечення для відстеження країв. Альбумін (B) вимірювали за допомогою набору ELISA у 24-годинних зразках сечі, зібраних у метаболічних клітинах наприкінці дослідження. Дані представляють середнє значення ± SE 6 щурів/група. * Значний порівняно з АБО та С; # незначний порівняно з аналогом 2% NaCl; * значний порівняно з аналогом NaCl 4% (P

Крім того, дієта з високим вмістом солі спричинила значне збільшення розміру адипоцитів, особливо у щурів OP. Гіпертрофія адипоцитів може посилити резистентність до інсуліну у щурів OP через збільшення потоку жирних кислот та збільшення тригліцеридів у циркуляції. Було показано, що сіль підвищує рівень жирних кислот в крові (17), і наші дані, що вказують на гіпертрофію адипоцитів, свідчать про можливе збільшення циркулюючих жирних кислот.

Це дослідження було підтримано грантом Національного інституту охорони здоров’я HL-54810, грантом Американської асоціації серця (AHA) та докторською стипендією доктора А. Д. Добріана від середньоатлантичного філіалу AHA.