Вплив різних дієтичних рівнів DL-метіоніну та аналога DL-гідрокси на антиоксидантний статус молодих індичат, інфікованих вірусом геморагічного ентериту

Анотація

Передумови

Результати експериментів, що стосуються курчат-бройлерів та індичат, вказують на те, що підвищений рівень дієтичного метіоніну (Met) може покращити антиоксидантний захист тканин у швидко зростаючих птахів. Це є важливим фактором, оскільки вірусні інфекції викликають окислювальний стрес. Метою цього дослідження було перевірити гіпотезу про те, що дієти з індички з підвищеним вмістом Met можуть пригнічувати процеси окислення, викликані інфекцією, спричиненою вірусом геморагічного ентериту (HEV), і що зазначений ефект визначається хімічною формою цієї амінокислоти: DL-метіонін (DLM) або DL-гідрокси-аналог Met (MHA).

Результати

Вміст дієтичного метану на 40% вище рівня, рекомендованого NRC (1994), посилив перекисне окиснення ліпідів у тонкому кишечнику, що призвело до підвищення рівня малонового діальдегіду (MDA) та перекису ліпідів (LOOH), але це також стимулювало антиоксидантні механізми кров та печінка індичат, заражених ВГЕ. У порівнянні з DLM, MHA сприяв виникненню більш важких симптомів окисного стресу, таких як підвищений рівень MDA в кишечнику, а також зниження активності глутатіонпероксидази (GPx) та здатності плазми до скорочення заліза (FRAP).

Висновки

У заражених HEV індиків дієти зі збільшеним вмістом Met не мали чіткого антиоксидантного ефекту, що було відзначено у неінфікованих птахів. Прооксидантна активність Met, яка спостерігається в стінці тонкої кишки, пригнічується в крові та печінці індиків, швидше за все, через посилений синтез сечової кислоти та глутатіону. У порівнянні з MHA, DLM надала більш сприятливий вплив на аналізовані параметри окислювально-відновного статусу в тонкому кишечнику, крові та печінці індиків.

Вступ

Через низький рівень метіоніну (Met) у натуральних кормових інгредієнтах, комерційні раціони для птахів доповнюються Met-кормами, переважно DL-метіоніном (DLM) або аналогом Met-гідрокси (MHA), як DL-2-гідрокси-4 - (метил) бутанова кислота [30]. Експериментальні дані показали, що багато амінокислот, включаючи Met, виконують подвійну роль, харчову та імуностимулюючу [1, 3, 4, 9, 10, 16, 17, 31]. Згідно з новою концепцією, амінокислоти, які беруть участь і регулюють ключові метаболічні шляхи для поліпшення здоров’я, виживання, росту, розвитку, лактації та розмноження організмів, класифікуються як функціональні [32]. До цієї групи амінокислот належать сірчані амінокислоти, головним чином мет та цистеїн [32], які, як було встановлено, полегшують симптоми кишкового окисного стресу [21]. Результати деяких досліджень [2, 5] вказують на те, що значні переваги для здоров’я можна отримати за дуже високих дієтичних рівнів Met, майже вдвічі вищих, ніж рекомендованих для задоволення потреб росту курей. Сприятливий вплив Met на антиоксидантний статус індичат відзначався [11, 12, 24], коли вміст дієтичного Met був приблизно на 50% вищим, ніж рекомендований NRC [18].

Менш важкі симптоми окисного стресу в кишечнику у відповідь на дієтичні добавки Мет, які спостерігали Рут і Філд [21], можуть бути важливим фактором при вірусних та бактеріальних інфекціях птиці. Попередні дослідження продемонстрували, що вірусні та бактеріальні інфекції призводять до імуносупресії птиці [14, 22] та індукують окислювальний стрес у клітинах [13, 24, 27]. В експерименті, проведеному на курях, інфікованих вірусом хвороби Ньюкасла (NDV), у тканинах спостерігали численні метаболічні зміни, викликані окислювальним стресом, включаючи підвищення рівня малонового діальдегіду (MDA) та зменшення знижених концентрацій глутатіону (GSH) та діяльність антиоксидантних ферментів (супероксиддисмутаза - СОД, глутатіонпероксидаза - GPx, глутатіонредуктаза та глутатіон S-трансфераза) [24]. В іншому дослідженні [13] курей-несучок, інфікованих вірусом хвороби Марека (MDV), характеризувалося збільшенням рівня MDA та похідних карбонілу (PC), а також зниженням концентрації GSH та загального антиоксидантного статусу (TAS) у крові . Підвищений рівень MDA та зниження активності антиоксидантних ферментів (SOD та GPx) також були відзначені в крові курей, заражених вірусом пташиного інфекційного бронхіту (IBV) [27].

З огляду на вищевикладене, результати останніх досліджень видаються цікавими, оскільки вони припускають, що підвищення рівня дієтичного Мет може покращити імунний та антиоксидантний захист у молодих клінічно здорових індичат [11, 12, 15, 34]. Вищезазначене стосується дієт, доповнених DLM та MHA, які хімічно не є амінокислотою, а метаболічним попередником DLM, який легко перетворюється на L-метіонін при попаданні в тканини тварин [30]. Деякі експерименти з курами та індиками [20, 26 29] показали, що дієти з добавкою MHA у порівнянні з дієтичними методами лікування DLM відрізняються своїм впливом на поліпшення антиоксидантного статусу птахів, що проявляється збільшенням загальної та зниженої концентрації глутатіону в печінку. Тому виникає питання, чи посилення додавання синтетичного DLM або MHA до раціону птиці може полегшити симптоми окисного стресу у птахів, що зазнали вірусних інфекцій.

Метою цього дослідження було перевірити гіпотезу, яка постулює, що дієти з індички з підвищеним вмістом Met можуть пригнічувати процеси окислення, викликані інфекцією, спричиненою вірусом геморагічного ентериту (HEV), і що зазначений ефект визначається хімічною формою цієї амінокислоти: DL-метіонін (DLM) або DL-гідрокси-аналог Met (MHA).

Методи

Птахи та загальна практика управління

Дизайн експерименту: дієтичне лікування та експериментальне щеплення

Птахам було випадковим чином призначено чотири дієтичні процедури, по 30 птахів на групу, які отримували різні рівні та джерела доповненого методу. Загальна кількість птахів в одній обробці була адаптована до розміру загонів відповідно до щільності, що використовується при вирощуванні індички. Для фізіологічних досліджень з кожного лікування було відібрано 8 птахів, загальноприйнятих як мінімальна кількість тварин (індиків) з уніфікованим генотипом, що забезпечує надійні, відтворювані та статистично значущі результати без повторення процедури через високу мінливість у групі.

Було використано два джерела додаткового методу, DL-Met (Evonik Industries, Крефельд, Німеччина) або MHA (кальцієва сіль 2-гідрокси-4- (метил) бутанової кислоти, Novus International, Inc., Сент-Лоїс, Міссурі). Рівні дієтичного методу, розробленого з урахуванням рекомендацій NRC (1994), розцінювались як "низькі" (L), а лікування з підвищеним дієтичним вмістом Met більше ніж на 40%, як пропонували деякі селекційні компанії, було вказано як "високе" (H). Харчова цінність основних дієт (таблиця 1) була розрахована відповідно до польських таблиць аналізу кормів [25]. Аналізований вміст L або H Met (включаючи еквівалентну кількість MHA) становив 0,55 та 0,78% у віці 1–4 тижнів та 0,45 та 0,65% у віці 5–8 тижнів відповідно. Підготовка експериментальних дієт та визначення остаточного вмісту дієтичного метану описані раніше Янковським та співавт. [11]. У віці 42 днів індикам експериментально інокулювали 1 мл суспензії, що містить HEV у дозі 10 4,3 EID50, вводили в посіви зондом [14].

Збір зразків та аналізи

Біохімічні та антиоксидантні показники визначали в крові, гомогенатах тонкої кишкової стінки та печінці. Зразки крові (5 мл) збирали в пробірки, що містять гепарин (у концентрації 20 МО/мл), і відбирали проби тканин у 8 птахів на групу. Гепаринізовані зразки крові центрифугували протягом 10 хв × 3000 g при 4 ° C, а плазму зберігали при - 70 ° C до аналізу. Автоматичний біохімічний аналізатор HORIBA (Кіото, Японія) використовували для визначення глюкози в плазмі (GLU), триацилгліцеринів (TAG), загального холестерину (TC), сечової кислоти (UA), загального білка (TP) та альбуміну (ALB) та діяльність аланінамінотрансферази (ALT), аспартатамінотрансферази (AST), лужної фосфатази (ALP), креатинкінази (CK) та лактатдегідрогенази (LDH). Як описано раніше [19], у плазмі крові, печінці та стінці тонкої кишки індиків визначали такі показники окислювально-відновного статусу: концентрації пероксиду ліпідів (LOOH), малонового діальдегіду (MDA), сума зниженого GSH та окисленого GSH (GSH + GSSG), здатність плазми до зниження заліза (FRAP), вітаміну С, супероксиддисмутази (SOD) та каталази (CAT). Діяльність SOD та GPx визначали у крові та тканинах за допомогою діагностичних наборів Ransod та Ransel (Randox Laboratories, Crumlin, UK).

Статистичний аналіз

Статистичні розрахунки були проведені за допомогою двосторонньої ANOVA (програмне забезпечення Statistica 10.0) з урахуванням двох основних факторів (дієтичний ефект рівня Met та дієтичний ефект джерела Met), а також взаємодії між цими факторами (рівень × джерело взаємодії). У таблицях середні значення (n = 8) з об'єднаними SEM, а статистична значимість враховувалась на стор

Результати

Окисно-відновлювальні параметри тонкої кишкової стінки

Дієтичні методи лікування впливали на вибрані параметри окислювально-відновного стану в стінці тонкої кишки (табл. 2). Індички, що харчуються раціонами з більшим вмістом Met, характеризуються вищою активністю CAT (P = 0,008), нижча активність СОД (P Таблиця 2 Параметри окисно-відновного процесу стінки тонкої кишки у індиків, що харчуються дієтами з різними джерелами та вмістом Met (n = 8)

Біохімічні та окисно-відновні параметри плазми крові

Суттєвих відмінностей в аналізованих біохімічних параметрах крові індиків, що харчуються раціонами з різним вмістом і джерелами Мет, не виявлено, за винятком рівнів UA в плазмі (табл. 3), які збільшувались із збільшенням рівня включення дієтичного Met (P = 0,019). Значна взаємодія дози Met × джерело (P = 0,013) також спостерігався для рівнів UA у плазмі крові: вищий рівень DLM не впливав на вищезазначений параметр, тоді як вищий рівень MHA збільшував концентрацію UA у плазмі крові індиків.

Багаторазові зміни окисно-відновного статусу крові були відзначені у відповідь на різні рівні та джерела Мет в їжі (табл. 4). Дієтичний вміст Met не впливав на концентрацію вітаміну С, активність SOD, GPx і CAT або загальну антиоксидантну здатність, визначену в аналізі FRAP. Вищий рівень Met збільшив GSH + GSSG (P = 0,012) і LOOH (P = 0,035), і, як правило, знижували рівні MDA у плазмі крові індиків (P = 0,062). У порівнянні з DLM, MHA знизив концентрацію вітаміну С (P Таблиця 4 Параметри окислювально-відновного вживання у індиків, що харчуються дієтами з різними джерелами та вмістом Met (n = 8)

Окисно-відновні параметри печінки

Обидва експериментальні фактори, тобто рівень та джерело дієтичного Met, впливали на параметри окислювально-відновного статусу печінки індиків (табл. 5). Збільшення дієтичного вмісту Met призвело до збільшення активності CAT і SOD (P = 0,009 і P Таблиця 5 Параметри окислювально-відновного процесу печінки у індиків, що харчуються дієтами з різними джерелами та вмістом Met

Обговорення

У попередніх дослідженнях підвищений рівень дієтичного метану покращував антиоксидантний захист слизової оболонки кишечника. Збільшення вироблення глутатіону, більш високий рівень загальної антиоксидантної здатності та зменшення окислення білка спостерігались у слизовій оболонці кишечника курчат, які отримували дієти з доповненням ДЛМ [23]. Більш низькі рівні MDA були виявлені в слизовій оболонці дванадцятипалої кишки молодих індиків, які годувались дієтами з добавкою MHA [20].

Результати попередніх досліджень вказують на те, що підвищений дієтичний рівень Мет чинив антиоксидантну дію на птиці, що виявляється підвищеним рівнем UA в плазмі крові [6, 28] та посиленням активності таких важливих антиоксидантних ферментів, як SOD та GPx у крові [26]. У наших попередніх експериментах, проведених на неінфікованих індичат [11, 34], підвищений рівень дієтичного метану покращував антиоксидантні параметри плазми крові за рахунок підвищення активності СОД, загального рівня глутатіону та значень FRAP. У поточному дослідженні подібне збільшення дієтичного вмісту Met збільшило рівень UA в плазмі крові та покращило деякі показники окислювально-відновного статусу крові, тобто збільшило загальний рівень глутатіону та знизило концентрацію LOOH, але це не збільшило активність антиоксидантних ферментів або значень FRAP.

У цьому експерименті було відмічено підвищення рівня UA та значні зміни в аналізованих параметрах окислювально-відновного статусу в плазмі крові індиків, можливо, через антиоксидантну активність Met (вищу у випадку DLM) та окислювальний стрес, викликаний HEV інфекція. Інші автори також повідомляли про наявність окисного стресу в клітинах і тканинах, викликаного бактеріальними та вірусними інфекціями птиці. Симптоми окисного стресу включали збільшення рівнів MDA та зменшення концентрацій GSH та активності антиоксидантних ферментів [24], збільшення рівнів MDA та похідних карбонілу (PC) та зменшення концентрацій GSH та TAS у крові [13], зменшення активності антиоксидантних ферментів та збільшення рівня MDA [32].

Результати цього дослідження вказують, що дієтичний вміст Met приблизно на 40% перевищує рівень, рекомендований NRC (1994), посилює перекисне окиснення ліпідів у тонкій кишці, що призводить до збільшення рівня MDA та LOOH, але також стимулює антиоксидантні механізми кров та печінка індичат, заражених ВГЕ. У порівнянні з DLM, MHA збільшив активність SOD та CAT та зменшив активність GPx та значення FRAP.