Вплив ожиріння у дітей на запалення, вроджену частоту імунних клітин та метаболічну експресію мікроРНК

Ейрін Каролан, Ендрю Е. Хоган, Мішель Корріган, Гадінтшвер Гаоцве, Жан О'Коннелл, Ніам Фолі, Люк А. О'Ніл, Деклан Коді, Донал О'Ші, Вплив ожиріння у дітей на запалення, Вроджена частота імунних клітин, and Metabolic MicroRNA Expression, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, том 99, випуск 3, 1 березня 2014 року, сторінки E474 – E478, https://doi.org/10.1210/jc.2013-3529

Ожиріння характеризується хронічним запаленням, порушенням імунної регуляції та зміною експресії генів, пов’язаних із цукровим діабетом 2 типу та серцево-судинними захворюваннями. Ступінь, до якої ці зміни відбуваються при дитячому ожирінні, не до кінця визначена.

Метою було дослідити вплив ожиріння у дітей на частоту імунних клітин, активацію макрофагів, продукцію цитокінів та специфічні регулятори експресії метаболічних генів. Профілювання проводили на периферичній крові 29 дітей із ожирінням та 20 осіб, які не страждають ожирінням, за допомогою ПЛР в режимі реального часу, ІФА та проточної цитометрії.

Глюкоза натще була подібною в обох групах, але спостерігався вищий ступінь резистентності до інсуліну у пацієнтів із ожирінням (модель оцінки гомеостазу щодо резистентності до інсуліну, 4,8 проти 0,84; P

Ожиріння пов'язане з розвитком серйозних супутніх метаболічних захворювань, включаючи передчасні серцево-судинні захворювання та цукровий діабет 2 типу (T2DM).

Вплив ваги на імунну та метаболічну системи зараз вважається динамічним двонаправленим процесом. Зміни імунної системи при ожирінні у дорослих добре описані, але вплив ожиріння у дітей на імунний статус був менш вивчений і є основною темою цієї роботи.

Запалення лежить в основі багатьох супутніх захворювань, пов’язаних з ожирінням. Прозапальні цитокіни надмірно експресуються при ожирінні дорослих і пов'язані з метаболічним синдромом (1). Подібні прозапальні профілі були описані у дітей, повідомлялося про підвищений С-реактивний білок у дітей із ожирінням у віці від 3 років (2–4). Зазначено, що запальні параметри, такі як IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF-α, моноцитарний хемоаттрактантний білок-1 та активовані моноцити, є підвищеними, а протизапальний адипокін, адипонектин, знижений у людей із ожирінням. у порівнянні з дітьми з нормальною вагою (4–7).

Макрофаги відіграють певну роль в індукованій ожирінням резистентності до інсуліну і є основним фактором, що сприяє запаленню жирової тканини (8). У здорових суб’єктів макрофаги є регуляторними клітинами М2, що продукують протизапальний цитокін IL-10. При ожирінні макрофаги поляризуються до запального фенотипу M1, виробляючи прозапальний цитокін IL-1β. У міру того, як макрофаги стають провоспалительними, видалення рецептора гаптоглобіну-гемоглобіну CD163 стає регульованим і вимірним як розчинний CD163 (sCD163). sCD163 сильно пов'язаний з резистентністю до інсуліну незалежно від параметрів запалення, таких як TNF-α (9). Нещодавно ми визначили роль клітин iNKT у регуляції ваги та метаболізму при ожирінні дорослих (10). Виснаження клітин iNKT у мишей із ожирінням пов'язане з проліферацією жирових макрофагів M1 (10).

Ця мережа ожиріння, порушення регуляції імунних клітин та запалення взаємопов’язана з метаболізмом жирних кислот та сигналізацією інсуліну. Ми вирішили вивчити три критичні генні регулятори перед цими метаболічними шляхами. МікроРНК (miRs) - це невеликі некодуючі РНК, які модифікують експресію гена-мішені посттранскрипції та сильно пов'язані з метаболічними захворюваннями у мишачих моделей та дорослих людей (11). MiR-33a та MiR-33b експресуються в багатьох тканинах, включаючи макрофаги та цільовий білок, що зв'язує стерол-регуляторний елемент, який регулює гомеостаз ліпідів та холестерину (12). MiR-107 регулює чутливість до інсуліну, націлюючи на білки плазматичної мембрани кавеол, зменшуючи кількість рецепторів інсуліну та негативно впливаючи на передачу сигналів інсуліну нижче (13, 14). Підвищена експресія miR-107 була описана у дорослих популяцій із ожирінням, стійкими до інсуліну.

Це дослідження досліджує рівні sCD163, частоту циркулюючих клітин iNKT, цитокіновий профіль та експресію miR у дітей із ожирінням та неблудими.

Предмети та методи

Когорти вивчення

Етичне схвалення було надано Комітетом з етики, Дитяча лікарня Богоматері, Дублін, Ірландія. Батьки всіх пацієнтів дали письмову інформовану згоду.

Набрано сорок дев'ять дітей (29 осіб, що страждають ожирінням, 20 осіб, які не страждають на вік) у віці 6–18 років. Суб'єкти були класифіковані як люди з ожирінням або без них, використовуючи сентиальні таблиці Міжнародної групи з питань ожиріння (BMI). ІМТ розраховували як вагу (кілограми)/зріст (метри) 2. Рівні інсуліну (пікомолі/літр), глюкози (мілімолі/літр) та холестерину (мілімолі/літр) вимірювали після 12-годинного голодування. Всім учасникам було проведено клінічне обстеження, а детальний анамнез, що охоплював минулу історію хвороби, стан здоров’я, кількість та тяжкість попередніх інфекцій, виникнення недавньої інфекції та використання протизапальних препаратів. Діти з основним дефіцитом гормону, генетичним розладом, запальним станом або виникненням недавньої гострої інфекції були виключені.

Аналіз мононуклеарних клітин сироватки та периферичної крові (PBMC)

Зразки PBMC виділяли шляхом щільного центрифугування, як описано раніше (10). Клітини культивували в трьох примірниках протягом 24 годин лише в середовищі, середовищі з ліпополісахаридом (LPS) (10 мкг/мл) або середовищі з форболом міристат ацетатом (10 нг/мл) та іономіцином (5 мкг/мл). Сироватки та супернатанти клітин аналізували на вміст цитокінів, адипокінів та sCD163 методом ІФА.

Проточний цитометричний аналіз

PBMC фарбували для клітин iNKT з використанням моноклональних антитіл BD (6B11/CD3, BD Biosciences), як описано раніше (14). Клітини аналізували за допомогою програмного забезпечення FlowJo. Клітини електронно замикали (лімфогати) за їх щільністю та зернистістю та допитували для маркерів, що цікавили. Результати виражаються у відсотках від загальної кількості Т-клітин і визначаються з використанням потоку мінус-1 (контроль FMO).

Циркулюючий аналіз miR

Загальну РНК із збереженням малих РНК витягували з РВМС, використовуючи набір miRNeasy (QIAGEN) згідно з інструкціями виробника. Для всіх зворотних транскрипцій miR використовували специфічні для зворотної транскриптази праймери для miR-33a, miR-33b та miR-107 (Applied Biosystems). Індивідуальні кількісні ПЛР проводили на швидкій системі реального часу 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies) з використанням зондів miR-33a, miR-33b та miR-107 Taqman miR. SnoU6 використовували для нормалізації досліджень експресії miR. Відносну кратну зміну експресії розшифровки цільового гена визначали за допомогою методу порівняльного порогового циклу (2 -ΔΔCT).

Статистичний аналіз

Всі аналізи проводили за допомогою GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc). Результати виражаються як середнє значення ± SD. Групи порівнювали за допомогою t-критерію Стьюдента або U-тесту Манна-Уітні, як це підходить. Кореляцію параметрів визначали за допомогою коефіцієнтів кореляції Пірсона. Значення P повідомляються зі статистичною значимістю, встановленою в таблиці 1. Глюкоза натще була однаковою в обох групах, але у когорти з ожирінням спостерігалася підвищена резистентність до інсуліну. Середній рівень холестерину натще був підвищений, а рівень ліпопротеїнів високої щільності знижений у когорті з ожирінням порівняно з їхніми ненадебними аналогами (Таблиця 1).

Характеристика досліджуваних

Скорочення: ns, не значущі; HOMA-IR, модель гомеостазу оцінки резистентності до інсуліну; АТ, артеріальний тиск; z-ІМТ, z-оцінка для ІМТ. Дані виражаються як середнє значення ± SD.

Характеристика досліджуваних

кількісне визначення sCD163

Більш високий рівень sCD163 спостерігався в групі із ожирінням (142 проти 107 нг/мл; P = .03) (рис. 1А), і рівень позитивно корелював із збільшенням ІМТ (r = 0.32; P = .02), але не з голодуванням інсулін (рис. 1, В і С).

Запалення, імунні клітини та профіль мікро-мікрофлори при дитячому ожирінні. A, Рівні sCD163 (нг/мл), молекули, що виділяється прозапальними макрофагами в сироватці когорт, які не страждають від ожиріння та ожиріння. Рівні B і C, sCD163 корелюють з ІМТ, але не інсуліном натще. D, Scatterplot, що показує рівні циркулюючих клітин iNKT (виражені як відсоток Т-лімфоцитів), визначені за допомогою проточної цитометрії; та E, їх кореляція з рівнями sCD163 у когортах, що не страждають ожирінням та ожирінням. F, Scatterplot, що показує рівні прозапального цитокіну TNF-α (пг/мл). G, Scatterplot, що показує рівні лептину (пг/мл) у сироватці крові когорт, які не страждають від ожиріння та ожиріння. H, Scatterplot, що показує рівні адипонектину (пг/мл) у сироватці крові когорт, що не страждають від ожиріння та ожиріння. I, Scatterplot, що показує рівні IL-1β (пг/мл), що продукуються LPS-стимульованими PBMC з когорт, що не страждають від ожиріння та ожиріння. Цитокіни та адипокіни вимірювали в двох примірниках за допомогою ІФА. J – L, Рівні miR-33a (J), miR-33b (K) та miR-107 (L) (відносна експресія порівняно з ендогенним контролем), виявлені кількісною RT-PCR у циркулюючих PBMC з небідних та ожирілих когорт . *, P Рисунок 1D). Зміна клітин iNKT обернено корелювала з рівнем sCD163 (r = -0,33; P = .04) (Малюнок 1E).

Запальне цитокінове та адипокінове профілювання

Вищі рівні TNF-α були виявлені у дітей, що страждають ожирінням, порівняно з нобебезом (7,2 проти 5,5 пг/мл; Р = 0,01) (рис. 1F). Збільшення сироваткового лептину (1217 проти 460 пг/мл; P Рисунок 1, G та H). PBMC з обох когорт стимулювали LPS протягом 24 годин, а підвищена продукція IL-1β була продемонстрована в когорті з ожирінням (2108 проти 1518 пг/мл; P = .01) (Малюнок 1I).

профілювання miR

Було 4-кратне збільшення експресії miR-33a (P = .001) та 3-кратне збільшення miR-33b у когорті з ожирінням порівняно з нобезом (P = .017) (Малюнок 1, J та K) . Не було різниці в експресії miR-107 (малюнок 1L).

Обговорення

Запалення та вроджена імунна система відіграють ключову роль у патогенезі інсулінорезистентності, T2DM та атеросклерозу у дорослих (15). Це дослідження - спостережне дослідження виключно кавказької когорти дітей. Ми показали, що зміни частоти імунних клітин, цитокінового профілю та метаболічних генних регуляторів, що характеризують дорослий T2DM та атеросклероз, є у дітей із ожирінням до розвитку гіперглікемії або явних серцево-судинних захворювань.

Ожиріння асоціюється з хронічним низьким ступенем запального стану, ключовим фактором несприятливих метаболічних ефектів підвищеного ожиріння. Декілька типів імунних клітин, включаючи макрофаги, лімфоцити та нейтрофіли, широко описані в жировій тканині мишей із ожирінням та людей (16). Збільшення кількості циркулюючих моноцитів було описано при ожирінні серед дітей (6). Макрофаги M1 містяться у запаленій жировій тканині і виділяють велику кількість прозапальних цитокінів, таких як IL-1β та TNF-α (8). Запальні подразники запускають розщеплення рецептора поглинача CD163, отримуючи sCD163, маркер активації макрофагів (8).

Це дослідження повідомляє про підвищений рівень sCD163 у дітей із ожирінням, що відображає посилення активації макрофагів із поляризацією щодо прозапального підтипу M1. Проспективне дослідження майже 9000 дорослих датчан показало, що підвищена концентрація sCD163 у сироватці крові пов’язана з ризиком розвитку T2DM у п'ять разів, навіть коли дані скориговані на ІМТ, фізичну активність та ліпідний профіль (17). Хоча ми повідомляємо про кореляцію між ІМТ та sCD163, на відміну від досліджень у дорослих, sCD163 у дітей не корелює з резистентністю до інсуліну. Це може відображати більш ранню стадію запального спектру ожиріння. Чи потрібно використовувати sCD163 як біомаркер для визначення пріоритетності дітей для втручання у спосіб життя на основі майбутнього ризику метаболічних захворювань, буде потрібно перспективна оцінка.

Це дослідження демонструє знижену частоту циркуляції клітин iNKT у дітей, що страждають ожирінням, із зворотною залежністю між концентрацією sCD163 та кількістю клітин iNKT. Клітини iNKT є рідкісною підгрупою вроджених Т-клітин, які зв’язують вроджений та адаптивний імунітет і можуть виступати сполучною ланкою між імунною та метаболічною системами (10). Нещодавня робота на мишачій моделі продемонструвала, що миші, у яких відсутні клітини iNKT, мали підвищений приріст ваги, резистентність до інсуліну та поляризацію макрофагів M1 на дієті з високим вмістом жиру. Адоптивний передача клітин iNKT призвела до зменшення жиру в організмі та чутливості до інсуліну в поєднанні зі зменшенням частоти макрофагів M1 (10). Сучасне дослідження демонструє ту саму зворотну залежність між збільшенням поляризації макрофагів M1 (sCD163) та зниженням частоти клітин iNKT у дітей із ожирінням. Це ще один доказ того, що спостерігається порушення імунної регуляції може сприяти метаболічним порушенням, пов'язаним із ожирінням.

Підвищений рівень прозапальних сироваткових цитокінів раніше був описаний при дитячому ожирінні (6, 7). Schipper et al (6) вивчали нові циркулюючі медіатори запалення у дітей у віці від 6 до 16 років. Вони повідомили про підвищення рівня хемерину, IL-18, EGF та TNF-R2 у групі із ожирінням порівняно з худою групою (6). Ми продовжили це, продемонструвавши змінене вироблення цитокінів з PBMC. Стимульовані РВМС у дітей, що страждають ожирінням, виробляли значно більше ІЛ-1β, ніж у їх худих колег. ІЛ-1β вивільняється з макрофагів у відповідь на активацію великими мультипротеїновими комплексами, що називаються "запальними". IL-1β відіграє ключову роль у токсичності β-клітин підшлункової залози, прогресуванні запалення та індукції резистентності до інсуліну, і тому вважається високопатогенним при метаболічному захворюванні, пов’язаному з ожирінням (18). В даний час антагонізм IL-1β розглядається як можлива терапевтична стратегія при T2DM (19). Той факт, що PBMC у дітей, що страждають ожирінням, виробляє на 40% більше IL-1β, ніж PBMC у дітей, які не страждають ожирінням, викликає занепокоєння, враховуючи їх поточну резистентність до інсуліну та ймовірний підвищений ризик розвитку T2DM у майбутньому.

Вищі за трансляцію білка цитокінів малі некодуючі РНК регулюють експресію генів і беруть участь у точній настройці багатьох фізіологічних та патологічних метаболічних процесів. У людини було описано понад 1000 послідовностей, причому декілька з цих miR були виявлені в біології адипоцитів та енергетичному обміні (11). MiR-33 є ключовим регулятором ліпідного гомеостазу та ініціювання та прогресування атеросклерозу (20). Це дослідження демонструє збільшення як miR-33a, так і miR-33b у дітей із ожирінням - miR, які, як відомо, інгібують генерацію холестерину ліпопротеїнів високої щільності та зменшують клітинне окислення жирних кислот (20). MiR-107, причетний до резистентності до інсуліну у дорослих, подібний у когортах із ожирінням та небідними. Це свідчить про те, що деякі процеси, що лежать в основі інсулінорезистентності, у цьому віці ще можуть не відбуватися, і підкреслює важливість раннього втручання навіть при встановленому ожирінні у дітей. Ідентифікація нерегульованих miR може в кінцевому підсумку надати біомаркери, які підтримують цілеспрямовані втручання для тих, хто найбільш ризикує ускладнитися.

Обмеження цього дослідження полягає в тому, що когорти не відповідали за статусом пубертатного періоду або резистентністю до інсуліну. Потрібні подальші дослідження, щоб визначити вплив як на чіткі відмінності, які ми спостерігали між когортами ожиріння та негрубими людьми.

Таким чином, ожиріння у дітей, пов’язане з резистентністю до інсуліну, впливає на імунну систему на багатьох рівнях, включаючи вироблення цитокінів, поляризацію макрофагів, вроджену частоту імунних клітин та регулювання експресії генів. Ці зміни були причинно пов’язані з початком метаболічних захворювань у зрілому віці та свідчать про майбутню траєкторію ожиріння дітей до розвитку Т2ДМ та передчасних серцево-судинних захворювань.

Подяка

Ми вдячні дітям та сім'ям, які брали участь у нашому дослідженні, та працівникам ендокринної сестри в Дитячій лікарні Богоматері, м. Крумлін, за всю їх допомогу та підтримку.

E.C. та A.E.H. підтримуються Національним дитячим дослідницьким центром. Група з імунології ожиріння підтримується Ірландською радою з досліджень охорони здоров’я, Національним дитячим дослідницьким центром, Ірландія, та програмою стипендій UCD Newman. Н.Ф. та Л.А.О. підтримуються Європейським грантом на дослідження. E.C. та A.E.H. підтримуються Національним дитячим дослідницьким центром, Ірландія.

Короткий зміст розкриття інформації: Автори заявляють, що немає конфлікту інтересів.