Вплив ожиріння на взаємозв’язок експресії мРНК лептину та розміру адипоцитів в анатомічно різних складів жиру у мишей

Анотація

лептин, гормон, який виробляється переважно в адипоцитах, має глибокий вплив на споживання їжі, витрату енергії та метаболізм (1, 7, 22, 36, 52, 54, 66). Концентрації лептину в плазмі позитивно корелюють з різними показниками жирності, такими як загальна маса жиру, відсоток жиру та індекс маси тіла як у людей, так і у гризунів (10, 17, 32, 44, 51), що свідчить про те, що лептин може функціонувати як гуморальний сигнал жирової маси як частина регуляторного механізму енергетичного балансу (29, 53).

язок

Експресія мРНК лептину та секреція білка регулюються багатьма факторами, включаючи інсулін, глюкокортикоїди, катехоламіни та TNF-α (6, 47, 48, 55, 61). Голодування різко пригнічує експресію гена лептину, а годування відновлює експресію мРНК лептину до рівнів, що не дотримуються протягом 4–7 год (5, 41, 48). Ефекти голодування та годування на рівні мРНК лептину частково опосередковані концентрацією циркулюючого інсуліну та ефектом інсуліну на метаболізм адипоцитів (38, 48). Раніше ми показали, що рівні мРНК лептину та швидкість секреції білка сильно корелюють між собою та з обсягом адипоцитів у пахових, перигонадальних та заочеревинних жирових депо худих молодих мишей у постабсорбтивному стані (самці C57BL/6J у віці 10 тижнів) ). Нахили ліній регресії, що відносять рівень мРНК тканинного лептину до середнього об'єму адипоцитів, трохи вищі в перигонадальних, ніж у пахових та заочеревинних жирових депо, і на обсяг адипоцитів припадає 64% зміни рівня мРНК тканинного лептину у цих мишей ( 65). Ці результати забезпечують механістичну основу фізіологічної ролі лептину як гуморального сигналу жирової маси.

Хоча концентрація лептину в плазмі крові, як правило, вища у людей із ожирінням, ніж у нежирних людей, проте концентрація лептину в плазмі на одиницю жирової маси виявляється більш розсіяною і, можливо, нижчою, у людей старшого віку та людей із ожирінням порівняно з пацієнтами із нормальною вагою (10, 28, 35, 45, 50, 51). Основний механізм зміни концентрації лептину в плазмі на одиницю жирової маси у людей із ожирінням не ясний. Концентрації лептину в плазмі крові також вищі у людей із ожирінням, ніж у худих мишей (17, 31). Однак точний зв’язок між експресією гена лептину та розміром адипоцитів в анатомічно відмінних жирових депо у ожирілих мишей або людей не ясний. Дослідження показують, що концентрація лептину в плазмі на одиницю жирової маси є важливим параметром енергетичного гомеостазу у людей та гризунів (4, 9, 42, 56, 57, 62, 63). Низькі концентрації лептину в плазмі на одиницю жирової маси пов’язані зі збільшенням рівня ожиріння у індіанців Піма та збільшенням ожиріння у Леп об/+ миші (9, 42), тоді як високі концентрації лептину в плазмі на одиницю жирової маси асоціюються з худим фенотипом та стійкістю до ожиріння, спричиненого дієтою, у кількох моделях мишей (4, 56, 57, 62, 63).

У цьому звіті ми систематично досліджували взаємозв’язок рівня мРНК лептину з об’ємом адипоцитів в анатомічно відмінних жирових депо на чотирьох мишачих моделях ожиріння та порівнювали результати з результатами худих молодих мишей. Конкретні запитання, які ми задали, такі. 1) Чи рівні рівнів мРНК лептину на одиницю об’єму адипоцитів подібні між анатомічно різними жировими депо у мишей із ожирінням та подібні до рівня худих молодих мишей? 2) Чи поширюється позитивна кореляція між рівнем мРНК лептину та обсягом адипоцитів від малих до гіпертрофічних адипоцитів у мишей із ожирінням?

Тварини та збір зразків жирової тканини.

Виділення та розмірне фракціонування адипоцитів.

Адипоцити виділяли шляхом перетравлення колагенази, як описано раніше (43). Для фракціонування за розмірами виділені адипоцити з однієї жирової прокладки (0,5–1 г) суспендували у 20 мл бікарбонатного буфера Кребса-Рінгера, доповненого 4% BSA та 1 г/л глюкози, у конічній пробірці об’ємом 50 мл і обережно перемішували. Потім адипоцитам давали плавати протягом 90 с, і клітини в дні 10 мл буфера збирали (невелика фракція). До решти адипоцитів додавали десять мілілітрів свіжого буфера. Клітини змішували і давали можливість знову плавати протягом 30–45 с, і відбирали адипоцити в дні 10 мл буфера (фракція середнього розміру). Нарешті, адипоцити з верхніх 5 мл буфера збирали після того, як решта адипоцити знову змішували в 20-міліметровому буфері і залишали плавати протягом 10–15 с (велика фракція). Частину адипоцитів у кожній фракції використовували для визначення об'єму клітин, а решта клітин використовували для приготування РНК (див. Нижче). Репрезентативний результат - розподіл розмірів трьох фракцій розміру адипоцитів із параметричної жирової подушечки 3-місячної жінки об/об миші, показано на рис. 1.

Рис. 1.Стовпчаста діаграма середніх значень та СЕ обсягу адипоцитів (мкг ліпіду/клітина) (A), рівні мРНК для лептину (B) і TNF-α (C.) (як співвідношення до β-актину, довільні одиниці) у паховій (Ing), епідидимальній (Epi) та заочеревинній (Ret) жировій тканині у самців мишей C57BL/6J віком 10 тижнів (худі, n = 30) (9), 10-тижневий чоловік C57BL/6J чоловік Леп об / Леп об миші (об/об, н = 10), 5-місячний чоловік C57/BL/6J-A р миші (A р, n = 5), 11 самців мишей C57BL/6J у віці (старий, n = 6) та 8-місячних самців мишей C57BL/6J з високим вмістом жиру, що харчуються (HFD, n = 5). Обсяги адипоцитів, рівні мРНК лептину та рівні мРНК TNF-α суттєво відрізнялись серед моделей на тваринах (P

Визначення середнього розміру адипоцитів жирових тканин та розмірів ізольованих адипоцитів.

Середній об’єм адипоцитів у зразках жирової тканини визначали, як описано раніше (3, 65). Обсяги клітин ізольованих адипоцитів визначали за допомогою мікрофотографічного методу, раніше описаного DiGirolamo (12) та Ashwell et al. (3). Коротко, пофарбовані метиленовим синіми адипоцити були сфотографовані зі збільшенням × 100 за допомогою світлового мікроскопа Nikon Eclipse E400, підключеного до цифрової камери та комп’ютера. Діаметри щонайменше 200 адипоцитів (ідентифікованих за їх забарвленими ядрами) від кожного зразка вимірювали на мікрофотографіях. Середній розмір адипоцитів (виражений у мкг ліпіду/клітина) ізольованої популяції адипоцитів (або частки розміру) розраховували за формулою Голдріка, обсяг = πd[3 (SD) 2 + d 2]/6, де d є середнім діаметром адипоцитів, а SD - стандартним відхиленням діаметрів адипоцитів, припускаючи щільність ліпідів = 0,915 г/мл (19).

Визначення рівнів мРНК за допомогою кількісної RT-PCR.

Кількісна RT-PCR із використанням β-актину в якості внутрішнього контролю була використана для визначення рівня мРНК лептину, TNF-α та глюкокортикоїдного рецептора, як описано раніше (65). Загальну РНК екстрагували з жирової тканини або ізольованих адипоцитів за допомогою реагенту TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Близько 1–5 мкг загальної РНК було перетворено в кДНК за допомогою випадкових гексамерів та зворотної транскриптази M-MLV (Invitrogen). Комплементарну ДНК кількісно ампліфікували за допомогою ПЛР, використовуючи специфічні праймери для гена, що цікавить, у поєднанні з праймерами для β-актину протягом обмеженої кількості циклів, які знаходились в межах експоненціального діапазону ампліфікації для обох генів. Послідовності праймерів для лептину, TNF-α, глюкокортикоїдного рецептора та β-актину були такими, як повідомлялося раніше (65), а рівні мРНК для цікавлячих генів виражалися як відношення до мРНК β-актину для нормалізації вихідного введення РНК.

Статистичний аналіз.

Рис.2.Зв'язок між рівнем мРНК лептину та середнім розміром адипоцитів в анатомічно виражених жирових тканинах у самців мишей C57BL/6J віком 10 тижнів (худих молодих мишей) (A і B) (11), 10-тижневий чоловік C57BL/6J чоловік Леп об / Леп об миші (об/об) та 11-місячних самців мишей C57BL/6J (старі) (A), 5-місячних самців мишей C57/BL/6J-A y (A y) та 8-місячних самців мишей C57BL/6J +/+ на дієті з високим вмістом жиру (HFD) (B). Пунктирна лінія представляє лінію регресії для зведених даних пахових, епідидимальних та заочеревинних жирових депо худих молодих мишей (A і B).

Взаємозв'язок між рівнем мРНК лептину та об'ємом адипоцитів у жировій прокладці у мишей із ожирінням.

Для визначення механізму, який може враховувати переважне зниження рівня мРНК тканинного лептину відносно середнього обсягу адипоцитів у депігонадальному жировому депо ожирених мишей, співвідношення рівнів мРНК лептину та об’єму адипоцитів в межах однієї перигонадальної та пахової жирової прокладки було обстежили. Адипоцити, виділені з кожної перигонадальної або пахової жирової подушечки чотирьох мишей HFD та двох 3-місячних самок C57BL/6J Леп об / Леп об миші (об/об) були розділені на три розміри за допомогою флотаційного методу, описаного у дослідницьких розробках та методах. На малюнку 3 представлений репрезентативний результат фракціонування за розміром, тобто розподіл за розміром трьох фракцій розміру адипоцитів, отриманих із параметричної жирової подушечки самки об/об миша. Діаметри (середнє значення ± SD) для великих, середніх та малих фракцій становили 92,6 ± 28,7, 67,0 ± 29,2 та 37,6 ± 20,4 мкм, що відповідає середньому об'єму адипоцитів 0,506, 0,225 та 0,048 мкг ліпід/клітина відповідно і суттєво відрізнялися (P

Рис.3.Розподіл адипоцитів за розміром за фракціями розміру, виділених із параметричної жирової подушечки 3-місячної жінки C57BL/6J Леп об / Леп об миша (ob1). Діаметр комірки в мкм. Відкриті бруски, великі фракції (великі); сірі смуги, фракція середнього розміру (середня); суцільні бруски, невелика фракція (мала).

Визначали рівні мРНК для лептину та глюкокортикоїдного рецептора (як контроль), а також середні обсяги адипоцитів у частках розміру кожної жирової прокладки та зв’язували їх між собою (рис. 4). Позитивна кореляція між рівнем мРНК лептину та об’ємом адипоцитів була присутня в кожній перигонадальній та паховій жировій прокладці, але нахили ліній регресії були постійно нижчими в перигонадальній, ніж у пахових жирових прокладках як у HFD, так і в об/об миші (дані від 2 репрезентативних мишей HFD представлені на рис. 4A і 2 об/об мишей на рис. 4B). Жодної кореляції між рівнем мРНК глюкокортикоїдних рецепторів та об'ємом адипоцитів не спостерігалося ні в HFD, ні в об/об миші (рис.4, C. і D, відповідно).

Рис.4.Зв'язок між рівнями мРНК лептину та об'ємом адипоцитів (A і B) та між рівнями мРНК глюкокортикоїдних рецепторів (GR) та об’ємом адипоцитів (C. і D) в межах пахової (коло, Ing) або перигонадальної [квадрат, Епі у самців та параметріальний (Pm) у самок] жирова подушечка у двох 8-місячних самців з високим вмістом жиру мишей C57BL/6J, що харчуються (HFD1 та HFD2) (A і C.) та дві 3-місячні жінки C57BL/6J Леп об / Леп об миші (ob1 та ob2) (B і D).

Багаторазовий регресійний аналіз використовували для кількісної оцінки відповідних ефектів розміру адипоцитів та депо-походження на рівні мРНК лептину у мишей HFD (табл. 1). У зведеному наборі даних розміру фракцій як пахової, так і перигонадальної жирової подушечки чотирьох мишей HFD, об'єм адипоцитів (P

Таблиця 1. Багаторазовий регресійний аналіз ефектів розміру адипоцитів та депо-походження на рівні мРНК лептину та глюкокортикоїдного рецептора у фракціях розміру адипоцитів із пахових та перигонадальних жирових подушечок чотирьох 8-місячних мишей C57BL/6J з дієтичним харчуванням

Залежна зміннаNР. 2 Незалежні змінні Розмір комірки Депо походження βPβPРівень мРНК лептину240,660,82 р, Старі миші та HFD. Крім того, рівні мРНК лептину на одиницю об’єму адипоцитів також знижувались у мишей A y та HFD порівняно з тими худими молодими мишами. На відміну від висновків у худих молодих мишей (10-тижневих мишей C57BL/6J), що рівні мРНК лептину на одиницю об'єму адипоцитів дещо вищі в перигонадальних, ніж у пахових жирових депо (65), рівні мРНК лептину відносно об'єм адипоцитів був значно нижчим у перигонадальних, ніж у пахових жирових депо у всіх обстежених мишей з ожирінням. Разом ці результати дозволяють припустити, що ожиріння саме по собі, незалежно від етіології, має різний вплив на експресію гена лептину в анатомічно різних депо жирів, що призводить до зниження рівня мРНК лептину на одиницю об’єму адипоцитів у перигонадалі, ніж у пахових жирових депо у ожирілих мишей.

Ця робота підтримується премією Американської асоціації діабету за кар'єрний розвиток, пілотом та техніко-економічною нагородою від Нью-Йоркського центру досліджень ожиріння (DK-26687) та Національними інститутами охорони здоров'я DK-63034 (R01), DK-64773 (R01), та DK-063068 (P30).