Вплив активованого як-білка на гемопоез та пов’язані з ним цитокіни при радіаційно-індукованій травмі у мишей

Ябін Дуан

1 кафедра клінічної фармації, дочірня лікарня університету Цинхай, Сінін, Цинхай 810001, Китай

Сінчен Яо

2 Відділення радіотерапії онкології, Народна лікарня Цинхай, Сінін, Цинхай 810007, Китай

Джунбо Чжу

3 Фармацевтичний факультет, медичний коледж, Університет Цинхай, Сінін, Цинхай 810001, П.Р. Китай

Юнпін Лі

4 Кафедра традиційної китайської медицини, Медичний коледж, Університет Цинхай, Сінін, Цинхай 810001, Китай

Жуанлінг Чжан

5 Департамент біологічних ресурсів, Коледж інженерії екологічного середовища, Університет Цинхай, Сінін, Цінхай 810016, Китай

Сюецзяо Чжоу

Іцзе Цяо

3 Фармацевтичний факультет, медичний коледж, Університет Цинхай, Сінін, Цинхай 810001, П.Р. Китай

Мен Ян

5 Департамент біологічних ресурсів, Коледж інженерії екологічного середовища, Університет Цінхай, Сінін, Цинхай 810016, Китай

Сяньян Лі

6 Медичний коледж, Університет Цинхай, Сінін, Цинхай 810016, Китай, Китай

7 Державна ключова лабораторія екології та сільського господарства плато, Університет Цинхай, Сінін, Цинхай 810016, Китай

Анотація

Вступ

Іонізуюче випромінювання позитивно застосовується у сільськогосподарському виробництві, медицині та охороні здоров’я, наукових дослідженнях та національній обороні (1). Однак це також пошкоджує багато аспектів людської фізіології, включаючи клітини периферичної крові, ДНК кісткового мозку (2), імунно-пов'язані органи (3) та антиоксидантні ферменти (4,5). Науково-дослідний інститут армії США розробив перший протирадіаційний препарат - аміфостин, який був затверджений Управлінням з контролю за продуктами та ліками США (6). Аміфостин здатний значно зменшити загибель нормальних клітин після променевої терапії; однак побічні ефекти, включаючи гіпотонію, нудоту, блювоту та інші побічні реакції, обмежили його застосування (7). Тому проведення досліджень є обов’язковим для виявлення ефективного, природного нетоксичного ліки, що захищає від радіації та зменшує радіаційний збиток. Попередні дослідження зафіксували, що рослинні білки (8,9) і негемозв’язуючі залізо білки (10–12) чинять захисний ефект від радіації. Крім того, аргінін, глутамін, гліцин, мікоспориноподібні амінокислоти та незамінні амінокислоти можуть сприяти відновленню ваги, покращувати харчові умови білка та надавати антиоксидантну дію у щурів, які зазнали рентгенівського опромінення (13–15).

Попереднє дослідження, проведене авторами, показало, що активовані як білки витягуються із здорової тканини яків з Цінгай-Тибетського плато і містять велику кількість дрібних пептидів (не опубліковано). Як-активований білок спочатку був ідентифікований після обробки ізольованих тканин як-комбінації комбінацією променевої терапії та хіміотерапії, в результаті чого виявлено, що кількість зрілих білих кров’яних клітин є нормальною, тоді як активність Т-клітин, природних клітин-кілерів, моноцитів та нейтрофілів була незвично високий. Ізольована тканина як зазвичай готується з використанням методів екстракції, сепарації та очищення із застосуванням сучасних біотехнологій та технологій біологічної інженерії, що дозволяє їй всмоктуватися безпосередньо без травлення в кишковому тракті. На Цінхайсько-Тибетському плато є багато джерел активованого як-білка. Як-активований білок забезпечує насичене харчування без токсичності, не накопичується в організмі і діє як багатофункціональний фактор (16). Крім того, він здатний пригнічувати ріст пухлини, збільшувати кількість лейкоцитів і регулювати імунну систему (17).

Метою цього дослідження було оцінити вплив активованого як-білка на клітини периферичної крові, імунну функцію, вміст ДНК кісткового мозку, активність антиоксидантних ферментів та експресію білків, пов’язаних з апоптозом, при індукованій радіацією травмі у мишей. Також були досліджені основні механізми щодо потенційних захисних ефектів активованого як-білка. Результати поточного дослідження можуть свідчити про нові методи вивчення радіаційно-захисних речовин та клінічне застосування як-активованого білка.

Матеріали і методи

Матеріали та реактиви

Гідроліз зразка

Як-активований білок (33,5 мг) поміщали в ампер-флакон на 10 мл і додавали 6 мл HCl (6 моль/л). Флакон герметично закривали та інкубували протягом 24 годин при 110 ° C для гідролізу зразка. Потім зразок охолоджували при кімнатній температурі протягом 40 хв, фільтрували (розмір пор, 0,5 мкм) і фільтрувальний розчин додавали в 15-мл пробірку. Пробірку висушували у вакуумі при 90 ° С у багатовипарному випарнику. Після висушування залишок розчиняли у воді і вищезгаданий етап повторювали. Нарешті, упарюваний залишок розчиняли в 5 мл HCl (20 ммоль). Зразок мав гідроліз ундегону, коли флакон герметично закривали та інкубували протягом 24 годин при 110 ° С. Після фільтрації для видалення домішок зразок містився у фільтрувальному розчині, а потім додавали HCl (20 ммоль) для розчинення зразка.

Зразок дериватизації

Зразки (0,4 мл) додавали до 1 мл бікарбонату натрію (0,5 моль/л) і 0,4 мл розчину ацетонітрилу фторбензолу (1%) у мірній колбі (10 мл). Колбу інкубували при 60 ° C протягом 1 год і додавали розчин буферного гідрогенфосфатного калію (0,1 моль/л, рН 7). Суміш фільтрували через мікропористу мембрану (пори 0,22 мкм), потім негайно піддавали високоефективній рідинній хроматографії, як показано нижче.

Хроматографічні умови виявлення

Використовували такі хроматографічні умови: Column, Phenomenex Gemini 5 µ C18 (250 × 4,6 мм; Phenomenex, Inc., Торранс, Каліфорнія, США); довжина хвилі виявлення, 360 нм; температура колонки, 37 ° С; швидкість потоку, 1 мл/хв, завантаження проби, 8 мкл; і градієнтне елюцію рухомої фази А (0,05 моль/л ацетату натрію; рН 6,4) і рухомої фази В (ацетонітрил: вода = 1: 1; таблиця I).

Таблиця I.

Зразки амінокислот розділяють методом градієнтної елюентної хроматографії.

Час, хв Розчинник А (0,05 моль/л ацетат натрію; рН 6,4),%

0–5	74–65
5–15	65–60
15–20	60–45
20–25	45–30
25–30	30–20
30–35	20–2
35–40	2–2
40–42	2–74

Групи тварин та схеми дозування

Загалом 180 самців мишей куньмін (віком 6–8 тижнів, 22–25 г) було придбано в Центрі експериментальних тварин Університету традиційної китайської медицини Ганьсу (Ланьчжоу, Китай). Тварин пристосовували протягом тижня при 23 ± 2 ° C з постійною вологістю 55 ± 5% за 12-годинного циклу світло-темно та з вільним доступом до води та харчових гранул. У клітці було розміщено 10 тварин. Всього 60 мишей були випадковим чином розділені на нормальний контроль, опромінений контроль, позитивний контроль (аміфостин, 150 мг/кг) та групи високих, середніх та низьких доз активованого як-білка (10, 5 та 2,5 мг/кг відповідно; n = 10). Інші 120 мишей використовувались для подальших експериментів на 7 та 14 день після опромінення відповідно, щоб оцінити зміни різних показників у різні моменти часу. Нормальні контрольні та опромінені контрольні групи отримували фізіологічний розчин перорально, а всім іншим групам лікування вводили активований як білок (10, 5 або 2,5 мг/кг) перорально протягом 14 днів. Мишей у групі позитивного контролю обробляли інтраперитонеальною ін’єкцією аміфостину (150 мг/кг) за 30 хв до опромінення. Перед експериментами мишам знеболювали ін’єкцією ентероцелії 50 мг/кг 1% пентобарбіталу натрію (Propbs Bio-tech Co. Ltd, Пекін, Китай).

Модель радіаційного пошкодження

Для експерименту з опромінення використовувалась лікарня, що пов'язана з університетом Цинхай. Всіх мишей, за винятком контрольної групи, утримували в спеціальних коробках і один раз піддавали рентгенівському випромінюванню 5,0 Гр зі швидкістю 300 cGy/хв. Відстань від джерела до тварини становила 100 см. Час випромінювання: 100 сек (18,19). Після опромінення в дні 3, 7 та 14 були використані 180 мишей.

Збір зразків

Перед експериментами мишам знеболювали ін'єкцією ентероцелії 50 мг/кг 1% пентобарбіталу натрію. Очну кров забирали у мишей у всіх лікувальних групах через 7 днів після опромінення. Кожен зразок змішували з EDTA-2Na (Mingyuan Industry Co., Ltd, Чженчжоу, Китай) для запобігання коагуляції, а решту коагулювали для відділення сироватки шляхом центрифугування при 1000 × g протягом 10 хв при 4 ° C. Всіх мишей забивали за допомогою ін'єкції ентероцелії 50 мг/кг 5% пентобарбіталу натрію через 3, 7 та 14 днів після опромінення (n = 60 для всіх груп). Після жертвоприношення вилочкової залози та селезінки (без жиру) збирали, промивали фізіологічним розчином для видалення крові, висушували за допомогою фільтрувального паперу і зважували.

Кількість клітин та показники органів

Розріджувачі клітин крові (каталожний номер M-23D, партія 2013110701; Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, Шеньчжень, Китай) додавали до 20 мкл очної крові відповідно до протоколу виробників. Кількість клітин крові (лейкоцити-WBC, еритроцити-RBC, гемоглобін-HGB та тромбоцити-PLT) визначали за допомогою аналізатора клітин крові BC-2300 (Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.). Індекси органів розраховували за такою формулою: Індекс органу (%) = маса органу (г)/маса тварини (г) × 100 (20).

Вміст ДНК у кістковому мозку

Мишей приносили в жертву після збору очної крові. Праву стегнову кістку виділили, а м’язову тканину та кров видалили. Одну сторону головки стегнової кістки вирізали і 10 мл CaCl2 (0,005 моль/л) використовували для промивання кісткового мозку у центрифужну пробірку. Кістковий мозок поміщали в холодильник при 4 ° C на 30 хв, потім центрифугували при 693 × g на 15 хв при 4 ° C. Надосадову рідину викидали і використовували 5 мл 0,2 моль/л HClO4 для підкислення осаду. Потім осад перемішували, нагрівали до 90 ° С протягом 15 хв, охолоджували, центрифугували при 1350 × g протягом 10 хв при 4 ° С і фільтрували (пори 50 мкм). Поглинання (А) супернатанту визначали за допомогою УФ-спектрофотометра при 268 нм. Вміст ДНК розраховували за такою формулою: ДНК (мкг) = 40 × 50 × A (21).

Вміст IL-2 та IL-6 та експресія Bcl-2 та Bax. Набори ІФА (Bcl-2; кат. No 20141227.60284M; Bax; кат. No 20141227.60283M; IL-2; Кат. No 20141227.60019M; IL-6; Кат. No 20141227.60023M; Beijing RigorBio Science Development Co ., Ltd.) використовувались для вимірювання рівнів IL-2, IL-6, Bcl-2 та Bax у сироватці крові згідно з протоколом виробника.