Стійкість транскриптома гемопоетичного лінійного походження та представленість у зібраній периферичній крові PAXgene ™ із використанням одноланцюгових зондів кДНК SPIA для мікрочипів

Інформація про статтю

Основна лабораторія досліджень трансляційної медицини, Центр сера Джеймса Блека, вулиця Дау, Університет Данді, DD1 5EH, Великобританія Тел: 44 (0) 1382 386 349; Факс: 44 (0) 1382 386 419; Електронна пошта: [захищена електронною поштою] або [захищена електронною поштою] * Автори однаково сприяли цій роботі.

стійкість

Анотація

Вступ

Розробка високоякісних біомаркерів для прогресування хвороби, цільової взаємодії, фармакодинамічних ефектів та ефективності сполук є центральним для трансляційних зусиль, спрямованих на створення персоналізованої медицини. Однак ідентифікація таких біомаркерів часто ускладнюється відсутністю доступу до тканин-мішеней із безпосередньою біологічною участю. Таким чином, периферична кров (ПБ) стає дедалі привабливішим джерелом сурогатного матеріалу замість тканини-мішені як фокус для виявлення та застосування біомаркерів, представляючи одне з найбільш доступних та практичних джерел біологічного матеріалу, зібраного в клініці, і дозволяє значною мірою неінвазивний метод повторного аналізу у одного і того ж пацієнта (Burczynski and Dorner, 2006).

Транскрипційне профілювання з PB можна досягти за допомогою ряду методологій та пов'язаних з ними робочих процесів; наприклад a) цільна кров, b) збагачені мононуклеарні фракції (PBMC) або c) вибрані/збагачені специфічні гемопоетичні лінії. Природно, що кожен із цих підходів має певні переваги та недоліки. Представлення гемопоетичних ліній в PBMC або виділених/збагачених фракціях, хоча і не вимагає введення стратегій зменшення глобіну перед експериментами з мікрочипами, природно обмежується досліджуваними лініями, і декілька клітинних ліній, як наслідок, відмовляються від подальшого аналізу. Глобальне профілювання РНК цільної крові, хоча і переважно для того, щоб захопити транскриптом крові в повному обсязі, традиційно вимагає стратегій зменшення глобіну до генерації зонда для аналізу мікрочипів, щоб зменшити перешкоди транскриптів глобіну з масивними зондами. На додаток до збільшення кроків обробки, ці процедури додають ризик артефактичної модуляції транскриптома, а корисність стратегій зменшення глобіну піддавала сумніву в декількох звітах (Liu et al. 2006; Li et al. 2008; Dumeaux et al. 2008).

Послідовність даних профілювання експресії генів цільної крові в значній мірі залежить від методу стабілізації зразка, що застосовується при флеботомії або під час зберігання (Debey et al. 2006; Rainen et al. 2002). Існують технології збору та зберігання зразків цільної крові, розроблені для спроби подолати проблеми, пов'язані з клінічним забором та стабільністю транскриптома PB. Одна з них, система РНК крові PAXgene ™ (PreAnalytiX, Hornbrechtikon, Швейцарія) складається з евакуйованої пробірки РНК PAXgene ™ для забору крові та обробного набору для виділення загальної РНК із цільної крові. Пробірка для збору PAXgene ™ містить власний реагент, який, як повідомляється, негайно стабілізує внутрішньоклітинну РНК протягом 3 днів при кімнатній температурі. Потенціал мінімізувати вимогу до термінової обробки зразків за рахунок підвищення стабільності транскриптома клінічної проби в цій матриці є центральним для відкриття надійних біомаркерів.

Тому в цьому дослідженні ми прагнули визначити робочий процес, який потенційно дозволяє (а) ефективно та негайно стабілізувати зібрану цільну периферійну кров та (б) генерувати зонд мікрочипів без потреби у зменшенні глобіну. На додаток до встановлення стійкості та відтворюваності таких методів, ми також оцінили представлення конкретних транскриптомів гемопоетичного походження, що надаються оціненими підходами, для того, щоб визначити оптимальний робочий процес.

Матеріали і методи

Збір та обробка зразків

Зразки крові відбирали у відповідного дозволеного здорового донора за допомогою системи збірних пробірок PAXgene ™ (PreAnalytiX, Hornbrechtikon, Швейцарія). Кров відбирали за стандартними процедурами флеботомії, по 2,5 мл дозували в кожну з 6 пробірок PAXgene ™ та обробляли відповідно до вказівок виробника (рис. 1). Коротко кажучи, половину зібраних зразків (n = 3) витримували при кімнатній температурі протягом 2 годин, а другу половину протягом 24 годин, як протягом встановленого виробником періоду стабільності зберігання 2–72 годин. Усі зразки інвертували 10 разів і заморожували при –20 ° C протягом ночі, а потім переміщували до –80 ° C для зберігання до виділення РНК (експеримент 1). Цю саму експериментальну процедуру повторювали, використовуючи відбір свіжої крові, отриманий від того самого донора в окремий день (експеримент 2).

Рисунок 1 Експериментальний робочий процес, який використовується для зберігання та обробки цільної крові, зібраної PAXgene ™. Цілу периферичну кров збирали у одного донора кожного з двох окремих днів (експерименти 1 та 2). Для кожного експерименту в кожну з 6 пробірок PAXgene ™ дозували 2,5 мл цільної крові. Після інверсії (10 разів) пробірки зберігали при кімнатній температурі протягом 2 годин або 24 годин. Потім всі зразки переносили до –20 ° C протягом ночі, а потім –80 ° C для зберігання, поки не проводились процедури виділення РНК із застосуванням набору для виділення РНК PAXgene ™. зонди sscDNA були синтезовані за допомогою ампліфікації NuGEN цільної крові SPIA з використанням ампліфікації NuNA GEN Ovation ™ РНК V2 та системи реагентів цільної крові. Потім sscDNA гібридизували з масивами Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0. WB –- Цільна кров, HG = Геном людини, PAX ’= PAXgene ™ і RT = Кімнатна температура.

Додаткові зразки крові того самого суб'єкта збирали в пробірки K3-EDTA та обробляли для повного аналізу крові на повністю автоматизованому аналізаторі повного аналізу крові Sysmex XE 2100.

Повна ізоляція РНК

Клітинні лінії кровотворення

Дані про експресію розшифровки ліній гемопоетичних клітин отримували з ряду джерел (див. Таблицю 4). РНК, отримана власноруч (В-клітини, Т-клітини та дендритні клітини) для гібридизації мікрочипів, була отримана із заморожених клітинних препаратів, придбаних у Lonza Biosciences (Базель, Швейцарія). Дані експресії транскриптів для широкого кола інших ліній клітин були отримані із загальнодоступних наборів даних, депонованих у Omnibus Gene Expression (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), номерів приєднання GSE1133 та GSE3982 (Jeffrey et al. . 2006; Су та ін. 2004). У сукупності цей набір даних надав джерело даних про експресію мРНК (отриманих за допомогою Affymetrix GeneChips ™) з широкого спектру ліній гемопоетичних клітин, підготовлених як градієнтом щільності, так і позитивною чи негативною парамагнітною ізоляцією кульки, з або без стимульованої диференціації в пробірці.

Таблиця 1 Показники виходу та якості для ізольованих загальних РНК та синтезованих одноланцюгових зондів кДНК.