Шлях уживання фруктози кишковою паличкою із залученням регулону фукози

Автор: Ганс Корнберг, 25 жовтня 2006 р. (Отримано на огляд 17 жовтня 2006 р.)

уживання

Анотація

Фруктоза може бути засвоєна кишковою паличкою за допомогою різноманітних мембранних білків, які розпізнають цукри з конфігурацією 3,4,5-d -арабіно-гексози. Тут ми описуємо мутанта, який позбавлений цих білків, але поглинає фруктозу через носій FucP, який зазвичай використовується для транспортування α-l-фукози; це означає, що фруктоза поглинається у формі α- або β-фруктопіранози. Для зростання асимільована фруктоза послідовно фосфорилюється АТФ та (i) манно (фрукто) кіназою, утворюючи фруктозу 6-фосфат та (ii) фосфофруктокіназу, утворюючи фруктозу 1,6-бісфосфат, який є членом центральних шляхів. гліколізу та глюконеогенезу. Мутація, яка надає організму здатність засвоювати фруктозу через регулятор фукози, була виявлена ​​як делеція гена fucA з подальшою індукцією протонно-зв'язаного транспортера фукози, FucP.

Раніше ми (1) описали властивості мутанта кишкової палички, позначеного HK 2148, який здатний рости на фруктозі як єдиному джерелі вуглецю, незважаючи на інактивацію всіх відомих шляхів, що включають систему фосфоенолпіруват/глікоза фосфотранферази (PT) для поглинання та використання цієї кетози (2). Вступ фруктози до цього штаму досягається за рахунок полегшеної дифузії через ізоформу нормально зв’язаного транспортера глюкози, PtsG, який, отже, вимагає забезпечення порівняно високих концентрацій фруктози в середовищі (км для зростання = ≈8 мМ) . Як і слід було очікувати від цього режиму засвоєння фруктози, ріст на цьому субстраті сильно пригнічується за допомогою аналогів глюкози, таких як метил-α-d -глюкозид (αMG). Однак культури HK 2148, випромінені протягом декількох днів при температурі від 37 ° до 20 мМ фруктози плюс 1 мМ αMG, дали початок подальшим мутантам, деякі з яких не тільки не пропускали наявність αMG при вирощуванні на фруктозі, але вирощували на цій кетозі в концентраціях набагато нижче (км для зростання 14 С] Фруктоза за HK 2298.

У той час як суспензії вирощеного на LB HK 2298 легко поглинали і включали 14 C з [14 C] фруктози при концентраціях до 0,1 мМ, подібні суспензії HK 2148 робили це лише в незначній мірі (дані не наведені). Ні PtsG, ні білки, зазначені пов'язаним з РТ фруктозним опероном, не брали участі в цьому поглинанні: похідне HK 2298, яке також несло ptsG: kanR (штам HK 2385), виросло на фруктозі і поглинало цю кетозу зі швидкістю, що не відрізняється від HK 2298, як і інші похідні HK 2298, що містять або fruA: kanR (штам HK 2578), або делецію, що охоплює промоторну область оперону фруктози, а також fruB і fruK (штам HK 2544).

Місцезнаходження гена, відповідального за поглинання фруктози.

Щоб уникнути можливих помилок через введення PT-зв’язаного фруктозного оперону, ряд штамів Hfr E. coli, що передають ДНК з різних точок походження та в різних напрямках та несуть транспон Tn10 у відомих місцях (3), схрещують із штамом HK 2578, похідна HK 2298, у якій активність FruA була видалена введенням fruA: kanR; всі екскон'юганти тестували на утримання маркера kanR. Ці стійкі до тетрацикліну колонії пройшли скринінг на предмет втрати здатності рости на 2,5 мМ фруктозі. Ми виявили, що штам Hfr BW6169, який несе argA: Tn10, розташований на хвилині 63,5 на карті зв'язку E. coli (4) і передає свою ДНК проти годинникової стрілки приблизно з хвилини 84,8, породив стійкі до тетрацикліну колонії, з яких 40% не вдалося виростити на фруктозі і яка також зайняла 0,5 мМ [14 С] фруктози лише за незначною швидкістю. Цей результат поставив передбачувану систему засвоєння фруктози в місці, близькому до argA. Це місце (5) було більш точно визначено трансдукцією HK 2578 з фагом, що несе fucP: Tn10, делецією гена, що визначає протонно-зв'язаний транспорт фукози, який знаходиться на рівні хв 63,2. Жоден із 116 отриманих трансдуктантів не виріс або не поглинув фруктозу.

Ідентичність системи поглинання фруктози з компонентом регулону фукози (6) досліджували за допомогою двох трансдуктантів argA: Tn10 від кросу [фаг P1, вирощений на BW6169 × HK 2578], один (HK 2621), який зберіг здатність до ростуть на фруктозі, а інший (HK 2622) - серед 40%, які її втратили. Ми спостерігали, що поглинання 0,5 мМ [14 С] фруктози вирощеним LB HK 2621 сильно інгібується 0,1 мМ-α- l - (-) - фукозою, але не d - (+) - фукозою (рис. 1А) . HK 2622 поглинав мічену фруктозу при l - (-) - фукозі (рис. 1B).

Вплив α- l -фукози на поглинання 0,5 мМ [14 С] фруктози. (A) Штам HK 2621 (Fuc-F +), що поглинає [14 C] фруктози окремо (○) та у присутності d - (+) - фукози (▴) або l - (-) - фукози (●) . (B) Штам HK 2622 (Fuc-F -), що поглинає [14 C] фруктози окремо (○) та у присутності l - (-) - фукози (●). Зверніть увагу на різницю в масштабі.

Крім того, суспензії вирощеного LB HK 2621 значною мірою поглинали α-l - [3 H] фукозу, тоді як подібні суспензії HK 2622 ні (рис. 2).

Поглинання 0,5 мМ [3 H] фукози штамом HK 2621 (Fuc-F +) (○) та штамом HK 2622 (Fuc-F -) (■).

Це поглинання HK 2621 (і його батьківської організації, HK 2578) відбулося швидко лише протягом перших декількох хвилин впливу ізотопу, а потім зросло лише незначною мірою, що вказувало на те, що поглинена фукоза не піддавалась подальшому метаболізму. Погоджуючись з цією інтерпретацією, ми спостерігали, що жоден штам, HK 2578 та HK 2621, не росли на α-l -фукозі, тоді як їхні фруктозонегативні батьки HK 2148 та HK 2632. Крім того, додавання 1 мМ-α-1 -фукози до культур HK 2578, що вирощують на 1–10 мМ фруктози, сильно перешкоджало зростанню, з кінетикою, що свідчить про конкурентне пригнічення (рис. 3); тоді як додавання α- l -фукози до культур HK 2632, що вирощують на 5–20 мМ фруктози, не мало такого ефекту (дані не наведені).

Діаграма Ханеса про вплив 1 мМ-α- l -фукози на ріст штаму HK 2578 (Fuc-F +) при різних концентраціях фруктози (○). Швидкості зростання за відсутності α- l -фукози відображаються як ●.

Ці спостереження припустили, що здатність поглинати і рости фруктозу через регулятор фукози пов'язана з мутацією у деяких членів цього регулону. Це було підтверджено порівнянням послідовностей ДНК його компонентних генів fucP, fucK та fucA, присутніх у фруктозопозитивних (Fuc-F +) штамах HK 2578 та HK 2621 та їх фруктозонегативних аналогах HK 2148 та HK 2622. Ми виявили, що послідовності ДНК fucP та fucK були ідентичними та точно відповідали послідовностям, опублікованим для цих генів (7), але область fucA HK 2148 та HK 2622 помітно відрізнялася від тієї, що присутня у HK 2578 та HK 2621. ДНК послідовність fucA у штамів HK 2148 і 2622 знову відповідала опублікованій послідовності, але продукт ПЛР цієї області в HK 2578 і HK 2621 був явно меншим (фіг. 4); більше того, праймери, які дали чудові продукти ПЛР та відтворювані послідовності ДНК у штамах Fuc-F - не змогли зробити це у всіх штамів, що виявляють фенотип Fuc-F +.

Продукти ПЛР регіонів fucA HK 2622 та HK 2621.

Метаболізм засвоєної фруктози.

Якщо фруктоза потрапляє через дерепресований носій фукози, вона потрапляє в клітини хімічно немодифікованою і, як очікується, буде піддаватися фосфорилюванню до фруктози 6-фосфату в присутності АТФ та манно (фрукто) кінази (Mak) (1); утворений таким чином фруктозо-6-фосфат далі фосфорилюється АТФ у присутності фосфофруктокінази (PfkA). Для перевірки цієї гіпотези використовували дві стратегії.

По-перше, гени, що визначають Mak + і PfkA + у HK 2298, були вибірково замінені їх негативними аналогами. Таким чином, HK 2298 був заражений фагом P1, вирощеним на штамі HK 2198, який несе mak-o котрансдуцибельний з argJ: Tn10 (8); > 70% стійких до тетрацикліну трансдуктантів не росло на фруктозі. Подібне скасування здатності рости на фруктозі спостерігалося, коли HK 2298 (який несе argHBCE, розташований при мінімумі 89,5) був заражений фагом P1, вирощеним на штамі, який був ArgHBCE +, а також несе pfkA (розташований при мінімумі 88,5). Трансдуктанти відбирали на планшетах, що містять гліцерин як джерело вуглецю, але не містять аргініну; всі ті, які більше не росли на глюкозі і, отже, були PfkA - також не змогли вирости на фруктозі.

Друга стратегія для перевірки постульованого шляху використання фруктози полягала у послідовному введенні генів для Mak + та пов'язаної з фукозою транспортної системи фруктози Fuc-F + у штам-реципієнт, позбавлений обох. HK 2140 має ці властивості (1). В одному підході його схрещували з фагом, вирощеним на Fuc-F + -штамі HK 2621, який також містив argA: Tn10: Жоден із стійких до тетрацикліну трансдуктантів не виріс на 2,5 мМ фруктозі. Оскільки було неможливо визначити, яка з багатьох трансдукованих колоній отримала ген, що специфікує Fuc-F +, ряд об'єднали та заразили фагами, вирощеними на штам Mak + HK 2193, який також несе argJ: kanR, котрадуцибельний з mak. Приблизно 40% стійких до канаміцину трансдуктантів виросло на фруктозі.

У зворотній послідовності фаги, вирощені на штам Mak + kanR 2193, схрещували з HK 2140: Знову ж, жоден з стійких до канаміцину трансдуктантів не виріс на 2,5 мМ-фруктозі, але коли колонія, що виросла на 20 мМ-фруктозі (і мала тому придбаний Mak +) був заражений фагом, вирощеним на Fuc-F + argA: штам HK 2621 Tn10, ≈40% стійких до тетрацикліну трансдуктантів виросло на 2,5 мМ фруктози.

Обговорення

Раніше ми узагальнили докази того, що фруктоза може потрапляти в кишкову паличку через низку білків, що охоплюють мембрану, і всі вони розпізнають 3,4,5- d -арабіногексозну конфігурацію d -фруктози, d -глюкози, d манноза, d-манітол та d -глюцитол (2). Таким чином, було несподівано, що у мутанта, позбавленого всіх цих носіїв, подальша мутація регулону фукози може ефективно впливати на засвоєння фруктози. Однак, хоча α-l -фукоза, яка в цій роботі показала конкуренцію з надходженням фруктози, не має 3,4,5-d -арабіногексозної конфігурації, вона разюче схожа на піранозну форму α- або β- d -фруктоза (схема 1)

Також було встановлено (9), що у водному розчині 57% фруктози знаходиться у β- d-піранозній формі. Тому цілком імовірно, що саме ця форма проникає в клітини через компонент FucA регулятора фукози і що відповідна мутація HK 2148, яка породила HK 2298, призвела до дерепресії гена fucP +. Це узгоджується з думкою (6), що гени системи фукози діють як регулон, що містить щонайменше три оперони, з яких fucP та fucA утворюють окремі частини, а субстрат, на який діє FucA, фукулоза 1-фосфат, відомо, що індукує транспортер фукози: Видалення fucA + призведе до накопичення 1-фосфату фукулози. Це також було б аналогічно спостереженням, що ріст фруктози через білки, що визначають поглинання маннози, глюцитолу та манітолу, відбувається шляхом дерепресії відповідних генів (2).

Наша нинішня демонстрація того, що як Mak +, так і PfkA + необхідні для росту HK 2298 та його похідних, підтверджує висновок, що фруктоза, поглинена системою Fuc-F +, згодом йде шляхом

Матеріали і методи

Штами та умови росту.

Використані штами бактерій наведені в таблиці 1. Бактерії вирощували при температурі 37 ° C або в рідкій культурі, що складається з відвару LB (25 г основи LB на літр води), або у певних середовищах (10), або на таких твердих середовищах з 2% агару. Щільність клітин вимірювали в 1-мл кюветах (1-сантиметровий промінь світла) з поглинанням при 600 нм (A600 1,0 дорівнює 0,26 мг сухої маси на мілілітр). Процедури, використовувані для кон'югацій, опосередкованих високочастотною рекомбінацією, та для трансдукцій, опосередкованих фагом P1, були описані Міллером (11).

Штами бактерій, використані в цьому дослідженні

Поглинання маркованих субстратів.

Поглинання 0,5 мМ [14 С] фруктози або 0,5 мМ [3 Н] фукози вимірювали як кількість радіоактивного матеріалу, утримуваного клітинами при 0,2 мг сухої маси на міліметр, струшуючи в неглибоких посудинах на водяній бані при 30 ° С . Проби (0,1 мл) відбирали у відомий час, швидко фільтрували через фільтри Millipore (Billerica, MA) (розмір пор, 0,45 нм) і промивали 2 × 5 мл 50 мМ фосфатного буфера, рН 7. Фільтри негайно занурювали в пластикові кювети, що містять 5 мл Ecoscint H (National Diagnostics, Atlanta, GA), і їх радіоактивність аналізували за допомогою сцинтиляційного лічильника LS 6500 MultiPurpose (Beckman Coulter, Fullerton, CA). [14 С] Фруктоза та [3 Н] фукоза були отримані від American Radiolabeled Chemicals (Сент-Луїс, Міссурі).

Аналіз геномної ДНК.

Процедури для ампліфікації геномної ДНК, а також маніпуляції та послідовності фрагментів ДНК були описаними раніше (1).

Подяка

Ми дякуємо доктору Мері Берлін (Єльський університет, Нью-Хейвен, штат Коннектикут) за її щедрі та часті подарунки мутантів кишкової палички.

Виноски

  • ↵ * Кому слід адресувати листування за адресою: Бостонський університет, вул. Каммінгтон, 5, Бостон, Массачусетс 02215. Електронна пошта: hlkbu.edu