Ролі вестибулярної системи при ожирінні та порушенні метаболізму глюкози у мишей, що харчуються дієтою

Наоюкі Кавао

1 Кафедра фізіології та регенеративної медицини Медичного факультету Університету Кіндай, Осакасаяма, Японія

Йошимаса Такафудзі

Масайосі Ішіда

Кацумі Окумото

2 Науково-дослідний інститут біології, Університет Кіндай, Осакасаяма, Японія

Хіронобу Моріта

3 Кафедра фізіології, Вища медична школа університету Гіфу, Гіфу, Японія

Масафумі Муратані

4 Кафедра біології геному, медичний факультет, Університет Цукуби, Цукуба, Японія

Хіросі Каджі

Пов’язані дані

Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Анотація

Вестибулярний апарат контролює рівновагу, поставу, кров’яний тиск і погляд. Однак ролі вестибулярної системи в обміні енергії та глюкози залишаються невідомими. У цьому документі ми досліджували роль вестибулярної системи у ожирінні та порушенні метаболізму глюкози, використовуючи мишей з вестибулярними ураженнями (VL), які харчувались дієтою з високим вмістом сахарози/жиру (HSHFD). VL індукували хірургічним шляхом або миш’яком. VL суттєво пригнічує жировий відклад, посилений HSHFD у мишей. Непереносимість глюкози була покращена за допомогою VL у мишей, яких годували HSHFD. VL притупив рівні адипогенних факторів та прозапальних адипокінів, підвищених HSHFD, в епідидимальній білій жировій тканині мишей. Β-блокатор антагонізував непереносимість жиру та глюкози в організмі, посилений HSHFD у мишей. Результати аналізу послідовності РНК показали, що HSHFD викликав зміни у генах, таких як інсуліноподібний фактор росту-2 та гліальний фібрилярний кислий білок, у вестибулярних ядрах мишей через вестибулярну систему. На закінчення ми показали, що порушення регуляції роботи вестибулярної системи впливає на стан ожиріння та порушує метаболізм глюкози, індукований HSHFD у мишей. Вестибулярний апарат може сприяти регулюванню заданих точок в умовах надлишкової енергії.

Вступ

Лінійне та кутове прискорення голови відчувається клітинами вестибулярного епітелію, а потім передається у вестибулярні ядра через вестибулярні нейрони. Нейрони вестибулярних ядер є контрольним центром сприйняття рівноваги, а вестибулярна система пов’язана з іншими нейрональними трактами, такими як вестибуло-окуломоторний та вестибуло-спинномозковий тракти, які регулюють погляд очей за допомогою вестибуло-окулярних рефлексів і постави відповідно [ 1,2]. Більше того, нейрони вестибулярного ядра підключаються до вегетативної нервової системи і регулюють серцево-судинну систему як вестибуло-вегетативні рефлекси [2,3].

Що стосується взаємозв'язку між вестибулярною системою та скелетними органами, попередні дослідження виявили, що вестибулярні ураження (VL) зменшують мінеральну щільність кісткової тканини (BMD) через симпатичну нервову систему у гризунів [4,5]. Luxa та співавт. повідомили, що лабіринтектомія сприяла збільшенню ремоделювання міофібри в м’язі підошви мишей [6]. Нещодавно ми виявили, що гравітаційні зміни впливають на м'язи та кістки через вестибулярний апарат у мишей [7,8]. У сукупності ці висновки дозволяють припустити, що вестибулярна система регулює опорно-руховий апарат частково через симпатичну нервову систему. Дисфункції у вестибулярній системі клінічно викликають запаморочення, запаморочення та нестійкість [9]. Тривалий космічний політ погіршує роботу вестибулярної системи у космонавтів, які відчувають ортостатичну непереносимість і нестійкість [3]. Однак роль вестибулярної системи в метаболічному гомеостазі ще не з'ясована детально.

Надлишок енергії зберігається у білій жировій тканині (ВАТ) у вигляді ліпідів і спричинює ожиріння, фактор ризику розвитку діабету [10]. Адипоцити диференціюються від мезенхімальних стовбурових клітин, а активація адипогенної диференціації супроводжується підвищеним рівнем активованого проліфератором пероксисоми рецептора γ (PPARγ), aP2, довголанцюгової ацил-КоА-синтетази (ACSL) 1 та ліпопротеїнової ліпази (LPL). При ожирінні WAT вивільняє прозапальні адипокіни, такі як фактор некрозу пухлини (TNF) -α, інгібітор активатора плазміногену (PAI) -1 та хемоаттрактантний білок моноцитів (MCP) -1, які погіршують метаболізм глюкози внаслідок індукції низьких -гресивне системне запалення [10]. Адіпонектин і лептин, що виділяються з жирової тканини, надають плейотропну дію в метаболізмі глюкози [10]. Циркулюючий адипонектин та лептин, що виробляються з ВАТ, негативно та позитивно пов'язані з масою жиру відповідно [11,12]. Попередні висновки показали, що активована система гіпоталамусу лептин/меланокортин, зниження рівня адипонектину та гіперінсулінемія посилюють симпатичну нервову діяльність при ожирінні [13–15].

У цьому дослідженні ми вивчали вплив та механізм дії VL на ожиріння та порушення метаболізму глюкози за допомогою дієтичних мишей із високим вмістом сахарози та жиру (HSHFD) з VL, індукованих хірургічними втручаннями та токсичними хімічними речовинами, для з’ясування ролі вестибулярна система при ожирінні, спричиненому дієтою, та порушенні метаболізму глюкози.

Матеріали і методи

Заява про етику

Усі експерименти на тваринах проводились відповідно до рекомендацій Національного інституту охорони здоров’я та інституційних правил використання та догляду за лабораторними тваринами в Університеті Кіндай. Усі процедури були схвалені Експериментальним комітетом із захисту тварин Університету Кіндай (номер дозволу: KAME-27-029). Всі зусилля були зроблені, щоб мінімізувати страждання. Мишей евтаназували надлишком ізофлурану.

Експерименти на тваринах

Самці мишей C57BL/6J були придбані у CLEA Japan (Токіо, Японія). Мишей годували довільно HSHFD (28% калорій з вуглеводів і 55% з жиру, східних дріжджів, Токіо, Японія) або звичайною дієтою (ND) і водою віком від 9 тижнів протягом 4 або 8 тижнів. Після 6 годин голодування мишей евтаназували надлишком ізофлурану та відбирали зразки тканин.

Хірургічні ураження вестибулярного апарату (sVL)

Самців мишей C57BL/6J (віком 7 тижнів) випадковим чином розподілили на 4 групи: ND/Sham (n = 8), ND/sVL (n = 8), HSHFD/Sham (n = 8) та HSHFD/sVL (n = 8). Операція VL була двосторонньо виконана згідно з методикою, описаною раніше у мишей під 2% -ною анестезією ізофлураном [7]. Коротко, вушні кісточки видаляли через зовнішній слуховий прохід. Вестибюль був ушкоджений шляхом введення стоматологічного римера через овальне вікно у внутрішньому вусі з подальшою абляцією за допомогою апарата припікання. Наслідки операції VL на вестибулярну систему оцінювали за допомогою тесту на плавання, як було описано раніше [23], в якому миші з вестибулярною дисфункцією не могли плавати і продовжували обертатися під теплою водою (35 ° C). У фіктивних мишей барабанна перетинка була видалена, але вушні кісточки та тамбур залишились. Після 2-тижневого періоду відновлення мишей годували ND або HSHFD протягом 8 тижнів.

Індуковані миш’яком вестибулярні ураження (aVL)

Самців мишей C57BL/6J (віком 9 тижнів) випадковим чином розділили на 4 групи: ND/Control (n = 8), ND/aVL (n = 8), HSHFD/Control (n = 8) і HSHFD/aVL (n = 8). ВЛ із застосуванням арсанілату натрію двосторонньо індукували згідно з описаним раніше методом [24]. Під 2% анестезією ізофлурану в порожнину середнього вуха вводили 10 мкл арсанілату натрію (Tokyo Chemical Industry, Токіо, Японія), розчиненого у фізіологічному розчині (1,5 мг/вухо). У контрольних мишей двобічно вводили однаковий обсяг сольового розчину. Мишей годували ND або HSHFD протягом 4 тижнів з 1 дня після процедури для aVL.

Лікування пропранололом

Самців мишей C57BL/6J розділили на 4 групи: ND/Control (n = 8), ND/пропранолол (n = 8), HSHFD/Control (n = 8) та HSHFD/пропранолол (n = 8). Пропранолол (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США) вводили 9-тижневим мишам через питну воду 0,5 г/л протягом 8 тижнів, як описано раніше [8].

Тести на толерантність до глюкози та інсуліну

Глюкозу (Wako, Осака, Японія) по 1,5 г/кг та інсулін (Eli Lilly Japan, Кобе, Японія) по 0,5 ОД/кг вводили мишам внутрішньочеревно для проведення тестів на толерантність до глюкози та інсуліну. Рівні глюкози в крові вимірювали до та через 30, 60, 90 та 120 хвилин після ін’єкції.

Вимірювання сили зчеплення

Силу зчеплення мишей вимірювали п'ять разів за допомогою вимірювача сили зчеплення (1027SM, Columbus Instruments, Columbus, OH, USA), і отримані результати виражали як середнє значення, як описано раніше [25].

Кількісна комп’ютерна томографія (QCT)

Після анестезії мишей 2% ізофлураном було проведено сканування QCT за допомогою рентгенівської КТ-системи (Latheta LCT-200; Hitachi Aloka Medical, Токіо, Японія) із наступними параметрами: струм струму 500 мкА, 50 кВп напруга в трубці та 48-мм осьове поле зору, як описано раніше [7]. При аналізі загальної маси жиру та м’язів, а також загального вмісту мінеральних речовин у кістках (ВМК) були отримані КТ-зображення (розмір вокселів 96 × 192 × 1008 мкм), і область, що представляє інтерес, визначалася як все тіло. При аналізі трабекулярної та кортикальної МЩКТ великогомілкової кістки були отримані КТ-зображення із ізотропним розміром вокселя 24 мкм, а області, що цікавлять, були визначені як сегменти 1680 мкм від 96 мкм дистально до кінця проксимальної пластини росту до діафізу та 2160 -μm сегментів середини діафізу відповідно. Зображення КТ аналізували за допомогою програмного забезпечення LaTheta (версія 3.41).

Гістологічний аналіз

WID епідидиму фіксували у 4% параформальдегіді протягом 24 годин, вкладали у парафін і розрізали на ділянки товщиною 4 мкм. Зрізи фарбували гематоксиліном та еозином та фотографували за допомогою мікроскопа (E800; Canon, Токіо, Японія) з ПЗЗ-камерою. Площі поперечного перерізу щонайменше 350 адипоцитів кількісно визначали за допомогою планіметрії, використовуючи ImageJ сліпим способом.

ПЛР-аналіз у реальному часі

Загальну РНК витягували за допомогою набору RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника. кДНК синтезували за допомогою набору зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). ПЛР-аналіз у реальному часі проводили за допомогою ABI PRISM 7900HT (Thermo Fisher Scientific) та Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific), як було описано раніше [25]. Праймери, що використовуються для ПЛР у реальному часі, показані в таблиці S1. Відносні рівні мРНК цільових генів аналізували методом ΔΔCt і нормалізували за рівнями 18S рРНК.

Хімія крові

Рівні інсуліну, лептину та адипонектину в сироватці крові оцінювали, використовуючи набір імуноферментних аналізів інсуліну миші (кат. № AKRIN-011T, FUJIFILM Wako Shibayagi, Gunma, Японія), лептин для мишей/щурів Quantikine ELISA (кат. MOB00, R&D systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) та імуноферментний аналіз на адипонектинові миші/щури (Кат. № AKMAN011, FUJIFILM Wako Shibayagi) відповідно.

Послідовність РНК

Коронкові зрізи товщиною в один міліметр отримували з мозку миші за допомогою матриці мозку миші (Муромачі Кікай, Токіо, Японія). Вестибулярні ядра збирали за допомогою пуансона згідно з Атласом мозку Аллена Миші [26]. Загальну РНК витягували із зразків біопсії за допомогою реагенту TRIzol (Thermo Fisher Scientific) та оцінювали за допомогою біоаналізатора Agilent з набором РНК 6000 Pico (Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Виснаження рРНК та синтез бібліотеки проводили за допомогою набору для виснаження рРНК NEBNext (E6310, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) та NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit (E7420, New England Biolabs) з 500 нг загальної РНК. Якість бібліотеки перевіряли за допомогою біоаналізатора Agilent з високочутливим набором ДНК (кат. № 5067–4626, Agilent). Кожна бібліотека була послідовно використана Illumina (2 × 36-bp здвоєних зчитувань) із наступним набором даних NextSeq500 v2 (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Файли FASTQ були імпортовані до CLC Genomics Workbench (вер. 10.1.1, Qiagen, Germantown, MD, США). Зчитання наносили на референтний геном миші mm10 і кількісно визначали для 49 585 анотованих генів. Читання на кілобазу стенограми на мільйон відображених значень (RPKM) нормувались квантильним методом.

Статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення ± стандартні похибки середнього значення. Істотні відмінності аналізували за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу з подальшим тестом Тукі-Крамера. Значення Р менше 0,05 вважали значущими. Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad PRISM 7.00 (GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).

Результати

Вплив sVL на ожиріння, спричинене HSHFD

Вага тіла, загальна маса жиру та розмір адипоцитів у епідидимальній ВАТ були значно вищими у мишей, що годували HSHFD, ніж у мишей, що годували ND (рис. 1А та 1В). sVL суттєво зменшив масу тіла, загальну масу жиру та розмір адипоцитів, підвищений за допомогою HSHFD, але не впливав на споживання калорій з HSHFD або без нього (рис. 1А та 1В). sVL пригнічував рівні мРНК ACSL1, посилені HSHFD в епідидимальній WAT мишей (рис. 1C), тоді як HSHFD не впливав на рівні мРНК PPARγ, aP2 або LPL в епідидимальній WAT мишей (рис. 1C). Загальна м’язова маса була значно нижчою у мишей, які годували HSHFD, а sVL значно зменшувала загальну м’язову масу з HSHFD або без нього (рис. 1D). Незважаючи на те, що годування HSHFD не впливало на вагу тканин м’язів підошви та шлунково-кишкового м’яза або міцність зчеплення у мишей, sVL значно зменшував масу тканини шлунково-м’язового м’яза у мишей, що годували ND або HSHFD (рис. 1D). Що стосується кісток, то годування HSHFD протягом 8 тижнів не впливало на загальний BMC або трабекулярний та кортикальний BMD у мишей (рис. 1E). sVL суттєво зменшив загальний BMC та трабекулярний BMD гомілки у мишей, яким годували ND та HSHFD (рис. 1E).