Полі (I: C) та CpG-ODN комбінована аерозолізація для лікування метастазів у легенях та протидії імунодепресивному мікросередовищу

Оригінальне дослідження

Повна стаття
Цифри та дані
Список літератури
Додаткові
Цитати
Метрики
Передруки та дозволи
PDF

Анотація

Скорочення

олігодезоксинуклеотиди, що містять мотиви CpG

Вступ

Недавні дослідження на мишах показали, що агоніст TLR3 Poly (I: C) може перетворювати асоційовані з пухлиною макрофаги легенів (TAM) із прихильників пухлини (M2) у такі, що мають пухлиноподібні властивості (M1). 9, 10 Перетворення пов'язане з сигналізацією Poly (I: C) через адаптер TICAM-1/TRIF для індукції експресії M1-пов'язаних генів у TAM, на відміну від інших агоністів TLR, які активують залежний від MyD88 сигнальний шлях. Більше того, агоністи TLR3 можуть також викликати вроджену імунну відповідь 11, 12 і було показано, що вони індукують протипухлинну активність, якщо їх застосовувати окремо або в поєднанні з протираковою вакциною. 13 - 17 Отже, аерозольні агоністи TLR3 можуть поліпшити вроджену CpG-ODN-вроджену імунну протипухлинну відповідь навіть у присутності мікросередовища імуносупресивної пухлини.

Тут ми оцінили аерозольне введення CpG-ODN у поєднанні з Poly (I: C) щодо його ефективності в одночасному блокуванні TAM-індукованої імуносупресії та підтримці постійної активації вроджених імунних клітин при лікуванні експериментальних метастазів меланоми B16 в легенях. Аерозолізацію CpG-ODN/Poly (I: C) також оцінювали в комбінації з дакарбазином, алкилирующим агентом, що застосовується як терапевтичний стандарт у пацієнтів з непрацездатною метастатичною меланомою.

Результати

Комбіноване аерозолювання Poly (I: C) та CpG-ODN зменшує кількість аргіназ- та IL-10-секретуючих пухлинно-асоційованих макрофагів

Як раніше спостерігали для агоніста TLR9 CpG-ODN, 7 аерозолізований агоніст TLR3 Poly (I: C) досяг бронхоальвеолярного простору та завербував імунні клітини мишей C57BL/6 (5–10 мишей в тій же аерозольній коробці), як продемонстрували значне збільшення F4/80 + CD11c- макрофагів та дендритних клітин у суспензіях, отриманих після ферментативного перетравлення легенів мишей, оброблених Poly (I: C), порівняно з мишами, обробленими сольовим розчином ( Рис. 1 ).

Опубліковано в Інтернеті:

Окрім блокування перетворення ТАМ у фенотип М2, нещодавно було показано, що лікування полі (I: C) сприяє дозріванню супресивних клітин, отриманих мієлоїдами (MDSC), незрілих клітин, часто підвищених у хазяїнах, що несуть пухлину, роблячи їх компетентними для NK-клітини активація. Дійсно, інкубація клітин CD11b + Gr1 + MDSC, оброблених полі (I: C), з NK-клітинами, індукувала підвищення регуляції експресії CD69 на поверхні NK-клітин та збільшувала продукцію їх інтерферону-γ. 10 Наші результати показали, що комбінація Poly (I: C) з аерозольованим CpG-ODN значно розширювала частоту клітин DX5 + у інфільтратах пухлини легенів та збільшувала їх цитотоксичну активність щодо клітин пухлини B16. Таким чином, активація NK-клітин може залежати від прямого впливу аерозольованого CpG-ODN на NK-клітини, індукованого блокуванням супресивних макрофагів, а також від опосередкованого впливу Poly (I: C) на NK-клітини через індукцію NK-клітини -активуючі молекули на MDSC, присутні в мікросередовищі пухлини.

На закінчення наше дослідження ідентифікує багаторазову аерозольну доставку імуностимуляторів, таких як агоністи TLR9 та TLR3, як зручний та простий підхід для локальної підтримки активації вроджених імунних клітин, одночасно інгібуючи поляризацію інфільтруючих пухлину макрофагів до фенотипу M2, мінімізуючи їх можливий системний побічні ефекти. Ця стратегія може покращити реакцію на стандартне лікування хіміотерапевтичними препаратами шляхом підтримки імунного мікросередовища, здатного протидіяти росту пухлини.

Матеріали і методи

Клітинні лінії та реагенти

Клітини меланоми мишей В16 регулярно підтримували при 37 ° С в атмосфері 5% СО2 в модифікованому Дульбекко середовищі Ігл, доповненому 10% фетальної телячої сироватки та 2 мМ глутаміну. Очищений фосфоротіонований агоніст TLR-9 ODN1826 (50-TCCATGACGTTCCTGACGTT-30), що містить мотиви CpG, був синтезований TriLink Biotechnologies. Низькомолекулярна поліінозинова-поліцитидилова кислота (Poly (I: C)), синтетичний аналог дволанцюжкової РНК (dsRNA) та агоніст TLR-3, була придбана у Invivogen (tlrl-picw-250). Дакарбазин постачав Medac GmbH (AIC033645021).

Миші та експериментальні протоколи

Всі експерименти проводились із використанням 8–12-тижневих самок мишей C57BL/6 (річка Чарльз), що утримувались у приміщеннях з ламінарним потоком при постійній температурі та вологості, з їжею та водою, наданими за бажанням. Експерименти були схвалені Комітетом з етики для експериментів на тваринах Фонду IRCCS IstitutoNazionaledeiTumori Мілана згідно з інституційними рекомендаціями. Мишам вводили внутрішньовенно (внутрішньовенно) 5 × 10 5 клітин меланоми В16 і обробляли, починаючи через 4 або 7 днів аерозолем з інтервалом від 72 до 96 годин, або дакарбазином, що вводили внутрішньочеревно (в/в) при 70 мг/кг, 5 днів/тиждень протягом 3 або 2 тижнів відповідно. Мишей зважували двічі на тиждень. Введення аерозолю проводили з використанням мишачої системи впливу на все тіло (EMMS), як описано. 7 Полі (I: C) (15 мг) або CpG-ODN (1,5 мг) розчиняли в 5 мл фізіологічного розчину і поміщали в блок небулайзера для лікування до 10 мишей, розміщених в аерозольній коробці; мишей піддавали дії аерозолю протягом 15 хв, при цьому об’єм рідини в небулайзері 5 мл майже витрачався за 10 хв. Наприкінці експериментів усіх мишей евтаназували та підрахували макроскопічні метастази в легенях. Всі в природних умовах експерименти повторювали принаймні двічі.

Гістологічне, імунофлуоресцентне та імуногістохімічне дослідження легенів

Зразки легенів, отримані від мишей, оброблених аерозольованим CpG-ODN, Poly (I: C) або CpG-ODN/Poly (I: C), як описано вище, або необроблені, фіксували у 10% нейтральному буферизованому формаліні, вкладеному в парафін, розділеному при 5 мм та фарбують гематоксиліном та еозином для гістологічної оцінки за допомогою світлової мікроскопії (Scan Scope Aperio, Nikon).

Кількісний аналіз ПЛР

Зразки легенів мишей, що носять клітини меланоми В16, оброблені дакарбазином протягом 3 тижнів або необроблені, розрізали на невеликі шматочки та гомогенізували за допомогою реагенту QIAzolLysis (QIAGEN, 79306). Загальну РНК виділяли відповідно до вказівок виробника, а зворотну транскрипцію проводили, використовуючи SuperScript III First-Strand (Invitrogen, 18080-044). ПЛР в режимі реального часу проводили за допомогою Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, P/N 4385612) із системою ПЦР StepOne у реальному часі (Applied Biosystems), використовуючи такі праймери: RAE1 rev: 5′-CCC TCC TCT GGC CTC TCC TT -3 ′; RAE1 для: 5′-CCC CAG TAT CAC CCA GCT TAC AT-3 ′; MULT1 rev: 5′-CAT CCA AGA GAG GTG GTG GT-3 ′; MULT1 для: 5′-AGC TCA TGT TGC ACT GGA AA-3 ′. Експресія гена нормалізувалась до GAPDH.

Багатопараметрична проточна цитометрія

В пробірці Дегрануляція NK та цитотоксичні аналізи

Статистичний аналіз

Дані ПЛР аналізували методом ΔΔCt. Відмінності в різних групах у всіх експериментах порівнювали за допомогою двостороннього непарного t-критерію Стьюдента.