Миші похилого віку C57BL/6JRj не страждають ожирінням під впливом дієти західного типу

Науково-дослідна робота

  • Повна стаття
  • Цифри та дані
  • Список літератури
  • Цитати
  • Метрики
  • Ліцензування
  • Передруки та дозволи
  • PDF

АНОТАЦІЯ

Ожиріння стало глобальною загрозою здоров’ю для кожної вікової групи. Добре відомо, що молоді миші (віком 10-12 тижнів), які харчуються дієтою західного типу (ЗЗ), страждають ожирінням і розвивають більш високий рівень холестерину та стеатоз печінки, тоді як чутливість до інсуліну знижується. Однак менше відомо про вплив СД на мишей похилого віку. Тому 10-тижневих (молодих) та 22-місячних (старшого віку), самців мишей C57BL/6JRj утримували або на WD, або на контрольній дієті (SFD) протягом 15 тижнів. На відміну від молодих мишей, миші похилого віку на ВД не виявляли більшої маси тіла або маси жирової тканини (АТ), що свідчить про захист від ожиріння, спричиненого дієтою. Крім того, рівні адипонектину та лептину у плазмі не впливали на годування ВД. Однак WD індукував більше печінкового накопичення ліпідів, а також посилював печінкову експресію маркера макрофагів F4/80 у мишей похилого віку. Не було суттєвих відмінностей у рівнях мРНК роз’єднання білка-1 або F4/80 у коричневих AT (BAT) або кількох маркерів кишкової цілісності в товстій кишці, що свідчить про те, що захист від ожиріння не обумовлений надмірною BAT або порушенням кишкового всмоктування жиру . Таким чином, миші похилого віку, на відміну від своїх молодших колег, виявилися захищеними від ожиріння, спричиненого дієтою.

повна

Вступ

Матеріали і методи

Тварина модель

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 1. Склад дієт.

Аналізи

Концентрацію глюкози в крові вимірювали за допомогою смужок Glucocard (28 350, Menarini Diagnostics), а тригліцериди та холестерин у плазмі крові оцінювали за допомогою звичайних клінічних досліджень. Рівні інсуліну в плазмі (Mercodia), адипонектину (R&D Systems) та лептину (DY498, R&D Systems) вимірювали за допомогою комерційно доступних ІФА. Індекс інсулінорезистентності (HOMA-IR-) оцінювали гомеостатичною моделлю наступним чином: рівні глюкози натще (мМ) x рівні інсуліну натще (мО/л)/22,5. Вміст тригліцеридів у печінці та BAT визначали кількісно за допомогою набору тригліцеридів FS * (Diasys) після підготовки тканини печінки, як описано раніше [6]. Коротко кажучи, 30 мг тканини інкубували протягом ночі при 55 ° C у спиртовому КОН (2: 3 60 мл EtOH 99% + 30 мл 30% КОН) до завершення травлення. Наступного дня до розщеплених зразків додавали 1 М MgCl2 (1: 1, об./Об.). Після 10 хв інкубації на льоду та подальшого центрифугування супернатант відсмоктували та аналізували за допомогою набору тригліцеридів FS * (Diasys). Рівні лактатдегідрогенази (LDH) оцінювали за допомогою набору для аналізу LDH (Abcam) відповідно до інструкцій виробника.

Вестерн-блот

Вестерн-блотинг для роз’єднання білка-1 (UCP-1) проводили, як описано раніше [7]. Коротко, жирову тканину BAT гомогенізували за допомогою риболізатора FastPrep (MP Biomedicals) у буфері, що складається з 10 мМ фосфату Na, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 1% тритону, 0,1% додецилсульфату натрію (SDS), 0,5% Na дезоксихолату, 0,2 % NaN3 та коктейль інгібітора протеази (Thermo Fischer Scientific). Для визначення концентрації білка використовували аналіз білка BCA (Pierce). Потім рівну кількість білка завантажували на 10% SDS-PAGE. Гелі переносили на мембрану нітроцелюлози 0,45 мкм і блокували у 5% нежирному сухому молоці (Bio-Rad) у 10 мМ буфері Tris-HCl зі 150 мМ NaCl та 0,5% Tween 20 pH 7,6 протягом 3 год. Далі мембрану зондували антитілом до UCP-1 (Sigma-Aldrich). Для контролю навантаження використовували β-актин. Потім додавали кон'юговане з пероксидазою хрону вторинне антитіло до TBST, що містить 5% нежирного сухого молока. Сигнали виявляли за допомогою посиленої хемілюмінесценції (Thermo Fischer Scientific). Аналіз проводили із зображенням J (NIH).

ПЛР у режимі реального часу

Аналізи експресії генів TaqMan (Thermo Fischer Scientific Inc.) використовували для аналізу рівнів мРНК кількох генів у тканинах печінки та товстої кишки та НДТ за допомогою кількісної RT-PCR (таблиця 2), згідно з протоколом, описаним раніше [8]. Коротко, вилучення РНК із тканин проводили за допомогою міні-набору RNeasy (Qiagen, Базель, Швейцарія) згідно з інструкціями виробника. Десять нанограм/мікролітрова РНК реверсували в кДНК за допомогою набору Multiscribe TM Reverse Transcriptase (Life Technologies, Thermo Fischer Scientific Inc.) відповідно до протоколу виробника. Детектор швидкої послідовності ABI 7500 був використаний для проведення кількісної RT-PCR. Дані були отримані як значення порогу циклу (Ct) та нормалізовані до гена домашнього господарства β-актину (∆Ct = Cttarget - Ctβ-актин). Для кожного гена аналізували дві проби, розраховували середнє значення Ct і використовували для аналізу. Розбіжності в експресії генів вираховували методом ΔΔCt, використовуючи мишей C57BL/6J, утримуваних на SFD як калібратор.

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 2. Маркери, виявлені за допомогою qPCR, за допомогою аналізів експресії генів TaqMan.

Гістологія та мікроскопія

Зразки жиру та печінки SC, GN та MES фіксували протягом 72 годин у 4% формальдегіді, промивали забуференним фосфатом сольовим розчином та вкладеним парафіном. Згодом 7 мкм зрізи для жиру та 4 мкм зрізи для тканин печінки депарафінізували та фарбували гематоксиліном/еозином (H&E). Зображення зрізів жиру та печінки, пофарбованих H & E, отримували за допомогою перевернутого мікроскопа Axiovert 200M Zeiss із нормальним освітленням та Axiovision Rel. 4.8.2 (Zeiss) при збільшенні x100. Потім визначали розмір і щільність адипоцитів на зрізах жиру, пофарбованих Н & Е, як описано раніше [9]. Коротко, для кожної миші було розраховано 10 областей за допомогою комп’ютеризованого аналізатора зображень. Згодом для обчислення поверхні клітини припускали сферичну морфометрію. Як повідомлялося раніше, стеатоз печінки оцінювали на порізах печінки, пофарбованих H & E [10].

Статистичний аналіз

Дані представлені як середні значення ± SEM для кількості досліджених тварин. Відмінності між групами аналізували за допомогою критерію Манна-Уітні-U. Значення р 11 - 14], ми виявили, що після 15 тижнів дієтичного впливу молоді миші, які отримували ЗД, важили значно більше у порівнянні з контрольними мишами, які годували СФД (р. У мишей похилого віку C57BL/6JRj не спостерігається ожиріння у західно- тип дієтичного впливу

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 3. Вага тіла та вага органів.

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 4. Метаболічні параметри.

Опубліковано в Інтернеті:
Опубліковано в Інтернеті:

Малюнок 2. Відсутність різниці у відносній експресії Ucp-1 та F4/80 у BAT та Occln, Zo-1 та Zon у товстій кишці мишей похилого віку. (а) Концентрація тригліцеридів у жировій тканині коричневого кольору. (b-c) Відносна експресія Ucp-1 (B) та F4/80 (C) у НДНТ. (d – f) Відносна експресія Occln (D), Zo-1 (E) та Zon (F) у товстій кишці. ° = p Рисунок 2. Відсутність різниці у відносній експресії Ucp-1 та F4/80 у BAT та Occln, Zo-1 та Zon у товстої кишки мишей похилого віку. (а) Концентрація тригліцеридів у жировій тканині коричневого кольору. (b-c) Відносна експресія Ucp-1 (B) та F4/80 (C) у НДНТ. (d – f) Відносна експресія Occln (D), Zo-1 (E) та Zon (F) у товстій кишці. ° = р 50% вуглеводів або білка. Тому кількість жиру та вуглеводів у нашому контрольному раціоні все ще становить 30%. Це може пояснити, чому миші, які годували контрольну дієту, досягали такої високої маси тіла. Іншим поясненням, чому контрольні миші досягають досить високої маси тіла, може бути те, що оскільки наша контрольна дієта складається з 40% білка, у мишей розвивається вища м’язова маса.

З віком ожиріння поступово зростає у людей із переважним накопиченням вісцерального жиру та зменшенням підшкірного жиру [15]. Дослідження показали, що гомозиготні миші-мутанти C57BL/6J Clock Δ19, мишача модель, призначена для вивчення старіння, розвивають ожиріння [16]. Крім того, маса тіла природних мишей C57BL/6JRj, що старіють, збільшується до 12 місяців з наступним зменшенням до 24 місяців [5]. Це може пояснити, чому в нашому дослідженні у мишей похилого віку не виникає ожиріння під впливом західної дієти.

Pettan-Brewer та Treuting виявили, що у колонії мишей C57BL/6J у 17% мишей похилого віку спостерігався насіннєвий везикуліт [17]. Оскільки ми хотіли передбачити ризик передчасної смерті внаслідок такої вищої швидкості розвитку вікових супутніх захворювань, ми вибрали n = 10 для мишей похилого віку. Для молодих мишей ми вирішили вибрати n = 5, оскільки попередні дослідження, проведені в нашій лабораторії, і існуюча література показали, що WD викликає ожиріння у молодих дорослих мишей. Крім того, ми очікували, що мінливість у цій групі буде набагато нижчою, оскільки у них лише рідко розвиваються супутні захворювання. Дійсно, у нашому дослідженні кілька мишей у групі похилого віку зазнали зміни кольору насінних залоз, що свідчить про везикуліт (дані не наведені) та більш високий рівень LDH-плазми. ЛДГ - сурогатний маркер пошкодження органів. Тому ми припускаємо, що мишам похилого віку може знадобитися додаткова енергія, яку постачає західна дієта, для боротьби з розвитком вікових супутніх захворювань. Для адекватної оцінки витрат енергії буде необхідним нове дослідження з використанням метаболічних клітин.

Оскільки у молодих мишей, які піддаються західній дієті, ожиріння розвивається, було б дуже цікаво простежити за наслідками тривалого впливу ВЗ від 10 тижнів до 24 місяців.

Старіння у людини пов’язане з гіперглікемією [18], гіперінсулінемією [18], гіперхолестеринемією [19] та порушенням функції печінки [20]. Однак у сторічників рівень глюкози та інсуліну в плазмі крові набагато нижчий, що свідчить про те, що вони мають кращу чутливість до інсуліну порівняно з молодими людьми [21, 22]. У дослідженні Hemmeryckx та співавт., 24-місячні миші демонстрували значно нижчі рівні інсуліну та глюкози у плазмі порівняно з їх аналогами 12 місяців та 10 тижнів, що свідчить про покращення чутливості до інсуліну [5]. У цьому дослідженні ми виявили, що опромінення WD 22-місячних мишей не змінювало рівні інсуліну та глюкози в плазмі, що призводило до подібного HOMA-індексу, що свідчить про те, що в похилому віці опромінення WD не індукує резистентність до інсуліну.

Ці результати суперечать тому, що відомо молодим тваринам. У дослідженні Surwit та співавт. Годування ВЗ призвело до збільшення маси тіла, що супроводжувалося гіперглікемією натще і гіперінсулінемією [2]. Однак у цьому дослідженні ми не змогли підтвердити резистентність до інсуліну, індуковану ВЗ. Це може бути пов'язано з генетичними та фенотиповими відмінностями між підштамами C57BL/6 щодо чутливості до HFD [23].

Ми помітили, що маса BAT збільшилася після 15-тижневого завантаження WD мишей похилого віку C57BL/6JRj. Це було пов’язано не лише з підвищеним накопиченням ліпідів. Петерсон та ін. також повідомлялося, що вага BAT зростала з віком у самців, але не у самок мишей C57BL/6J пропорційно зміні маси тіла з віком [24]. Раніше було показано, що короткочасне навантаження жиру на дорослих 10-тижневих самців мишей C57BL/6J підвищує потенціал горіння жирних кислот BAT, тоді як патологічне ожиріння, встановлене після тривалого впливу HFD, робить BAT нечутливим до жиру [23]. Старіння само по собі не впливає на кількість F4/80-позитивних макрофагів; однак вплив дорослих мишей C57BL/6J HFD протягом 8 тижнів призвів до зменшення кількості макрофагів у людей із ожирінням НДТ [25]. Крім того, у людей старіння асоціюється із зменшенням маси та активності НДТ [26]. Однак у нашому дослідженні аналіз рівня мРНК UCP1 та F4/80 не виявив суттєвих відмінностей між мишами похилого віку, що утримуються на WD або SFD, вказуючи на те, що в цьому дослідженні надмірне накопичення ліпідів у НДТ або накопичення макрофагів не враховує більш високих Вага BAT або для захисту від ожиріння, спричиненого дієтою.

На закінчення ми показали, що миші похилого віку, схоже, захищені від ожиріння, спричиненого дієтою. Однак західна дієта спричиняла збільшення печінкового накопичення ліпідів, а також посилення печінкової експресії F4/80, хоча ферменти печінки не зазнавали значного впливу. Загалом, ці висновки можуть бути актуальними для дослідників, які використовують мишачі моделі ожиріння або старіння.

Таблиця 1. Склад дієт.

Детальний склад дієт, що використовуються для експериментів. SFD = дієта зі стандартним жиром, WD = дієта західного типу.