Порівняльне дослідження жирової печінки, викликаної дефіцитом метіоніну та холіну у мишей C57BL/6N, що походять з трьох різних джерел

Су Хьон Кім

1 Фармацевтичний коледж Пусанського національного університету, Пусан, Корея.

Йонг Лім

2 Кафедра клінічної лабораторної науки, Коледж медсестер та медичних наук, Університет Донг-Еуї, Пусан, Корея.

Парк Джу Бін

2 Кафедра клінічної лабораторної науки, Коледж медсестер та медичних наук, Університет Донг-Еуї, Пусан, Корея.

Дже-Хван Квак

3 Фармацевтичний коледж, Університет Кюнгсунг, Пусан, Корея.

Кік-Джун Кім

4 Кафедра біомедичної лабораторної науки Коледжу Даекен, Кьонсан, Корея.

Чон Хі Кім

4 Кафедра біомедичної лабораторної науки Коледжу Даекен, Кьонсан, Корея.

Пісня HyunKeun

5 Кафедра мікробіології та імунології, Медичний коледж університету INJE, Пусан, Корея.

Джун Янг Чо

6 Лабораторія біохімії вправ, Корейський національний спортивний університет, Сеул, Корея.

Де Юн Хван

7 Департамент науки про біоматеріали, Коледж природничих ресурсів і наук про життя/Науково-дослідний інститут зближення життя та промисловості, Національний університет Пусан, Мірян, Корея.

Кіл Су Кім

8 Коледж ветеринарної медицини, Національний університет Кюнгпук, Тегу, Корея.

Янг-Сук Юнг

1 Фармацевтичний коледж Пусанського національного університету, Пусан, Корея.

Анотація

Вважається, що неалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) є найпоширенішим захворюванням печінки у всьому світі та основною причиною хронічного ураження печінки [1]. Він характеризується накопиченням ліпідів за відсутності значного вживання алкоголю і часто прогресує до стеатогепатиту, фіброзу печінки та гепатоцелюлярної карциноми [2]. Основною гіпотезою прогресування захворювання вважається підвищена сприйнятливість до запальних цитокінів та окисного стресу в жировій печінці [3,4,5]. Хоча з часу первісного визнання НАЖХ було проведено багато досліджень щодо НАЖХП, все ще існує багато прогалин, пов’язаних з нашим розумінням етіології, прогнозу, профілактики та лікування. Таким чином, добре встановлені експериментальні моделі тварин, що імітують патологію людини, дадуть прекрасну можливість подолати генетичну неоднорідність та різні фактори зовнішнього середовища, що впливають на НАЖХП.

Для індукування НАЖХП дієта з дефіцитом метіонін-холіну (МКД) найбільш широко застосовується у гризунів. Хоча це не викликає характеристик ожиріння через втрату ваги, воно дуже відтворюване і постійно індукує спектр НАЖХП залежно від тривалості [13,14]. Гризуни, що харчуються МКД дієтою, швидко розвивають клінічні патології від макровезикулярного стеатозу до фіброзу печінки [15]. Холін є субстратом у синтезі фосфатидилхоліну, який необхідний для ліпопротеїдів дуже низької щільності (ЛПНЩ), а його дефіцит індукує накопичення ліпідів у печінці [16]. Незамінні амінокислоти, дефіцит метіоніну зменшує біосинтез глутатіону (GSH) шляхом транссульфурації, а потім викликає окислювальний стрес і сприяє прогресуванню хвороби [17].

Метою цього дослідження було порівняння реакції на дієту з МКР у мишей C57BL/6N, отриманих із трьох різних джерел; Національний інститут оцінки безпеки продуктів харчування та лікарських засобів (NIFDS) в Кореї, США та Японії. Дослідження, що порівнює відповідь на дієту з МХД, може надати користь мишам, котрі походять з корейської NIFDS, у доклінічному тесті для розробки нового препарату НАЖХП.

Матеріали і методи

Тварини та лікування

6-тижневих самців мишей C57BL/6N отримували з трьох різних джерел. C57BL/6NKorl були люб'язно надані Департаментом лабораторних тваринних ресурсів Національного інституту оцінки безпеки продуктів харчування та лікарських засобів (NIFDS, Чеонджу, Корея). Інші дві групи штаму C57BL/6N були придбані у різних постачальників, розташованих у США (посилання A: C57BL/6N) та Японії (посилання B: C57BL/6N). Усі протоколи для тварин були схвалені Інституційними комітетами з догляду та використання тварин Національного університету Пусан (PNU-2015-0837). Мишей протягом 1 тижня перед використанням пристосовували до контрольованих до температури (22 ± 2 ℃) та вологості (55 ± 5%) приміщень з 12-годинним циклом світло/темрява. Їх випадковим чином розділили на 2 групи і протягом 3 тижнів годували дієтою з дефіцитом метіоніну та холіну (МКД) або контрольною дієтою метіоніном та холіном. Дієти були отримані від Dyets Inc. (Віфлеєм, Пенсільванія, США), а склад дієт показаний у таблиці 1. Для оцінки впливу добавок МХД на різні органи, печінку та нирки, а також депо жирової тканини, такі як вісцеральна (тобто гонадна) та підшкірна (тобто пахова) біла жирова тканина (WAT), та міжлопаткова коричнева жирова тканина ( BAT) були зібрані.

Таблиця 1

Інгредієнти Контрольна дієта (г/кг) MCD-дієта (г/кг)

L-аланін	5.1	5.1
L-аргінін	12.7	12.7
L-аспарагінова кислота	15.8	15.8
L-цистин	3.7	3.7
L-глутамінова кислота	28.9	28.9
Гліцин	6.2	6.2
L-гістидин	3.4	3.4
L-ізолейцин	6.1	6.1
L-лейцин	10.5	10.5
L-лізин-HCl	9.1	9.1
L-метіонін	1.7	0
L-фенілаланін	7.3	7.3
L-пролін	7.6	7.6
L-серін	7.2	7.2
L-треонін	4.6	4.6
L-триптофан	1.8	1.8
L-тирозин	5.7	5.7
L-валін	6.3	6.3
Кукурудзяний крохмаль	100	100
Декстрин	100	100
Сахароза	392,19	408,58
Целюлоза, мікрокристалічна	50	50
Кукурудзяна олія	50	50
Primex	100	100
Соляна суміш	35	35
Бікарбонат натрію	4.3	4.3
Вітамінна суміш	10	10
Холін бітартрат	14.48	0
Цитрат заліза	0,33	0,12
Разом	1000	1000

Параметри сироватки та гістологічний аналіз

Зразки крові отримували з черевної аорти кожної миші та переносили у пробірку для збору крові BD Microtainer (BD Life Sciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Зразки центрифугували при 3000 g протягом 15 хв для відділення сироваток, які зберігали при –80 – для біохімічного аналізу. Сироваткову активність аланінамінотрансферази (ALT) та аспартатамінотрансферази (AST) вимірювали за протоколом Рейтмана та Франкеля [18]. Активність АЛТ та АСТ пропорційна кількості пірувату та оксалоацетату, що утворюються протягом певного періоду часу, і вимірюється реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином у лужному розчині. Їх кількісно визначали спектрофотометрично за допомогою зчитувача MULTISKAN GO (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Рівні загального холестерину та тригліцеридів у сироватці крові визначали за допомогою автоматизованого хімічного аналізатора (Prestige 24I, Tokyo Boeki Medical System, Токіо, Японія).

Масляно-червоне фарбування O в тканинах печінки

Для оцінки рівнів накопичення ліпідів у тканині печінки зрізи 5 мкм лівої бічної частки печінки нарізали, занурювали в пропіленгліколь на 5 хв, а потім фарбували Олійно-червоним O (Sigma Aldrich). Після промивання 85% пропіленгліколем та дистильованою водою зрізи фарбували гематоксиліном протягом 2 хв до мікроскопічного дослідження.