Поліпшення поляризації жирового макрофага у мишей, що страждають ожирінням, що страждають ожирінням GHSR з високим вмістом жиру

1 Кафедра фізіології та патофізіології Наукового центру охорони здоров'я Пекінського університету; Ключова лабораторія молекулярної серцево-судинної науки, Міністерство освіти, Пекін, 100191, Китай

2 Відділ геріатрії, лікарня № 401 НВАК, Циндао, 266071, Китай

3 Відділення патології, Центральна лікарня м. Цзібо, Цзибо 255000, Китай

4 Кафедра клінічної лабораторії лікарні Сюаньву, Столичний медичний університет, Пекін 100053, Китай

5 Кафедра хірургії Мічиганського університету, Ен-Арбор, Мічиган, США

Анотація

1. Вступ

Як природний ліганд рецептора секретагогу гормону росту типу 1a (GHSR1a) [1,2], грелін є 28-амінокислотним пептидом, який секретується шлунковими окситичними залозами і октаноїлює O-ацилтрансферазою греліну (GOAT), єдиний ідентифікований фермент [3–5], який експресується переважно в шлунку, кишечнику та підшлунковій залозі, а також в інших місцях [6]. МРНК людського греліну кодує пептид 117 амінокислот, прегрегрелін [7], який піддається ендопротеолітичній обробці та посттрансляційній модифікації з отриманням ацилгреліну, дезацилгреліну та обестатину [8–12]. Рівень ацилгреліну в сироватці крові зростає з голодуванням, що свідчить про те, що це орексигенний гормон, який бере участь у ініціюванні їжі [13, 14]. Ацилгрелін регулює соматичний ріст, харчову поведінку та енергетичний гомеостаз у ссавців [15, 16], а також стимулює рухливість шлунку та тонкої кишки та секрецію кислоти у щурів [4, 17]. У нашому попередньому дослідженні ми виявили, що нокаут GHSR покращує метаболізм глюкози в скелетних м'язах у мишей [18].

Інсулінорезистентність є загальною основою патогенезу захворювань, пов’язаних із ожирінням [19], таких як метаболічний синдром, діабет 2 типу та атеросклероз, які є низькоякісними специфічними прозапальними станами. Взаємна причинно-наслідкова взаємодія інсулінорезистентності, ожиріння та запалення вказує на те, що запальні фактори, хемокіни та імуноцити можуть прямо чи опосередковано знижувати чутливість до інсуліну, беручи участь у виникненні та розвитку інсулінорезистентності.

Як імунні клітини, макрофаги є плюрипотентними і відіграють важливу роль у вродженому імунітеті. Поляризація макрофагів розглядається як фенотипова неоднорідність системи мононуклеарних фагоцитів [20]. В результаті клітинної диференціації, поширеного розподілу тканин та реагування на багато ендогенних та екзогенних подразників макрофаги поділяються на класичну або М1 та альтернативну або М2 поляризацію. Макрофаги М1 також називаються прозапальними макрофагами, а макрофаги М2 - протизапальними; перші секретні прозапальні фактори і мають прозапальну функцію, а пізніші мають протизапальну функцію і беруть участь у відновленні тканин [21].

Під час ожиріння посилюється інфільтрація макрофагів у жировій тканині, і переважно інфільтрований фенотип - M1 [21]. Взаємодія між макрофагами M1 і адипоцитами сприяє секреції запальних факторів, що призводить до інсулінорезистентності. Придушення запалення або індукція трансформації макрофагів в жировій тканині з М1 на М2 може полегшити інсулінорезистентність і поліпшити пов'язаний з цим метаболічний синдром.

У цьому дослідженні ми досліджували поляризацію макрофагів у жировій тканині мишей-нокаутів GHSR та сприяли новому механізму покращення чутливості до інсуліну GHSR-нокауту.

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали

Ацилгрелін був придбаний у компанії Phoenix Pharmaceuticals Inc. (Бурлінгейм, Каліфорнія). Кроличі анти-фосфо-AKT (Ser473) та антитіла до AKT були отримані з технології Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Щурячі анти-LAMP-2 (Mac3/84) антитіла та курячий анти-кролячий флуоресцеїн-ізотіоціанат-кон'югований IgG були від компанії Santa Cruz Biotechnology Inc. (Санта-Крус, Каліфорнія). DyLigh 594-козячий анти-щурячий IgG був від EarthOx LLC (EarthOx, CA).

2.2. Етичне схвалення

З тваринами, що використовувались у цьому дослідженні, поводились відповідно до Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин, опублікованого Національним інститутом охорони здоров’я США (публікація NIH № 85-23, переглянуте 1996 р.), І всі експериментальні протоколи були затверджені комітету з догляду та використання тварин Пекінського університету.

2.3. Тварини та лікування

Миші C57BL/6J, Ghsr1a нокаутовані (GHSR -/-) миші, були використані в цьому дослідженні. Ghsr1a миші-нокаути генів, у яких було видалено екзон 1 і екзон 2, були отримані від Шанхайського дослідницького центру біомодельних організмів (Шанхай, Китай) [18, 22]. Видалення Ghsr1a фрагмент гена підтверджено відсутністю відносних генних продуктів, досліджених за допомогою RT-PCR. 6-тижневих мишей-самців утримували у специфічних мікроізоляторах, що не містять патогенів, і утримували їх у регульованому середовищі (24 ° C, 12-годинний цикл світло-темрява, при включеному освітленні о 07:00 ранку). Доступні були регулярні чау та вода ad libitum. Мишам було призначено приймати стандартну лабораторну чау (NCD) або дієту з високим вмістом жиру (HFD) (45% жиру, D12451; Research Diets, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США) протягом 12 тижнів.

2.4. Культура клітин

Клітини RAW264.7, клітинні лінії клітин, схожих на перитонеальний мишачий миша, культивували в середовищі для зростання (модифіковане середовище Орла з високим вмістом глюкози (DMEM); Invitrogen, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), доповнене 10% інактивованою тепловою фетальною бичачої сироваткою (FBS; Біотехнології США), 100 одиниць/мл пеніциліну та 100 одиниць/мл стрептоміцину (Invitrogen) та інкубують при 37 ° C з 5% CO2. Клітини переробляли щотижня після відриву трипсину-ЕДТА. Всі дослідження проводили на клітинах RAW264,7 у пасажах 20-25. Потім клітини культивували LPS (10 нг/мл) або IL-4 (10 нг/мл) для отримання класифікованих (M1) або, як альтернатива (M2) поляризованих клітин.

2.5. Тест на толерантність до глюкози

Тест на толерантність до глюкози проводили, як описано [18]. Кров брали з порізу на кінчику хвоста через 0, 30, 60, 90 і 120 хв, і концентрації глюкози відразу виявляли за допомогою Глюкотренда від Roche Diagnostics (Мангейм, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника.

2.6. Екстракція РНК та кількісний аналіз ПЛР у реальному часі

Загальну РНК виділяли за допомогою реагенту Trizol. Зворотну транскрипцію та кількісну ПЛР у реальному часі проводили, як описано раніше [23–25]. ПЛР проводили в 25μл обсягу, що містить 2,5 нг кДНК, 5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 0,2μМ кожен праймер, 1,25 U полімерази AmpliTaq та 1μl 800 раз розведений запас SYBRGreen I з використанням мультиплексної кількісної системи ПЛР Mx3000 (Stratagene, La Jolla, CA). Програма ПЛР була такою: витримування 95 ° С протягом 7 хв; 95 ° С протягом 30 с, 60 ° С протягом 35 с і 72 ° С протягом 35 с. Кількісну оцінку експресії мРНК застосовували за допомогою порівняльного порогового методу (CT). Значення КТ домогосподарського гена β-актину віднімали від значення КТ цільового гена, щоб отримати △ КТ. Нормалізовані складчасті зміни експресії мРНК виявленого гена виражали як 2-

КТ = зразок КТ - контроль КТ. Реакції ПЛР проводили в двох примірниках і кожен експеримент повторювали 3-5 разів. Праймери, використані в цьому дослідженні, були показані в таблиці 1.

2.7. Вестерн-блот-аналіз

Як було описано раніше [23–25], жирову тканину та культивовані клітини швидко збирали, ретельно промивали PBS, а потім гомогенізували на льоду в буфері для лізису (50 мМ Tris-Cl, 15 мМ EGTA, 100 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, доповнений коктейлем інгібітора протеази, рН 7,5). Після центрифугування протягом 10 хв при 4 ° С супернатант використовували для вестерн-блот-аналізу. Концентрацію білка вимірювали за методом Бредфорда. Всього 60 μг білка з кожного зразка завантажували в гель SDS-PAGE. Білки переносили в мембрани фтористого полівінілідену. Мембрани інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з 5% знежиреного молока в солі, забуференному Tris, що містить Твін-20, з подальшою інкубацією протягом ночі при 4 ° C з окремими первинними антитілами. Специфічну реакцію було виявлено за допомогою кон'югованого IRDye другого антитіла та візуалізовано за допомогою інфрачервоної системи візуалізації Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Кількісну оцінку щільності зображення в пікселях проводили за допомогою інфрачервоної системи візуалізації Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

2.8. Гістологія H&E

Мишей глибоко знеболювали за допомогою пентобарбіталу. Жирову тканину придатків швидко видаляли і ретельно промивали PBS. Тканину фіксували у 4% параформальдегіді, зневоднювали, вбудовували у віск і розрізали на 6 μм. Діаметр кожного адипоцита в кожному полі вимірювали за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Image J (v1.48). Для кожної групи були виміряні розміри клітин приблизно 450 адипоцитів від 3-4 мишей та побудовані як гістограми.

2.9. Імунофлюоресценція

Мишей глибоко знеболювали за допомогою пентобарбіталу. Ту саму частину жирової тканини швидко видаляли і ретельно промивали PBS. Тканину фіксували у 4% параформальдегіді, зневоднювали, вбудовували у віск і розрізали на 6μм. Вкладені в парафін зрізи депарафінізовували, регідратували і промивали в PBS. Після кип'ятіння протягом 10 хв у 10 мМ натрій-цитратному буфері (рН 6,0) зрізи блокували в 1% BSA в PBS протягом 1 год при кімнатній температурі, а потім інкубували протягом ночі при 4 ° C лише з антитілом LAMP-2 (Mac3/84), а потім промивали в 1X PBS/0,1% Твін-20 тричі по 5 хвилин кожен. Потім зрізи тканин інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години з наступними вторинними антитілами (DyLigh 594-козячий анти-щурячий IgG). Контроль включав заміну первинного антитіла щурячим IgG. Ядра візуалізували фарбуванням Hoechst 33258 протягом 10 хв. Мікрофотографії були зроблені під конфокальним лазерним скануючим мікроскопом (Leica, Німеччина).

2.10. Статистичний аналіз

Дані були виражені як середні значення ± SEM. Для аналізу даних використовується програмне забезпечення GraphPad Prism. Одностороння ANOVA, тест Стьюдента-Ньюмана-Кіла (порівняння між кількома групами) або неспарений тест Стьюдента т-тест (між двома групами) використовувався відповідно. Значення Р
(а)
(b)
(c)
(d)
(e)

позначає Р # позначає Р
(а)
(b)
(c)

Конференція Китайської асоціації фізіологічних наук.

Конфлікт інтересів

Автори заявляють, що у них немає конфлікту інтересів.

Внески авторів

Фанг Юань і Цзянь Ма внесли однаковий внесок у цю роботу.

Подяка

Цю роботу підтримали гранти Національного фонду природничих наук Китаю (81670780 - Інь Лі та 81600695 - Сіньсінь Сян).

Додаткові матеріали

Показано додаткову фігуру та легенду в Інтернеті. (Додаткові матеріали)