Підвищена транскрипція гена QSOX1 Кодування Quiescin Q6 сульфгідрилоксидази 1 при раку молочної залози

Партнерська школа біологічних наук, Центр біомедичних наук, Лондонський університет Королівського Холлоуей, Лондон, Великобританія

qsox1

Партнерська школа біологічних наук, Центр біомедичних наук, Лондонський університет Королівського Холлоуея, Лондон, Великобританія

Партнерська школа біологічних наук, Центр біомедичних наук, Лондонський університет Королівського Холлоуей, Лондон, Великобританія

Партнерська школа біологічних наук, Центр біомедичних наук, Лондонський університет Королівського Холлоуей, Лондон, Великобританія

Партнерська школа біологічних наук, Центр біомедичних наук, Лондонський університет Королівського Холлоуей, Лондон, Великобританія

  • Михайло Соловйов,
  • Мішель П. Естевес,
  • Фахрія Амірі,
  • Марк Р. Кромптон,
  • Крістофер С. Вершник

Цифри

Анотація

Цитування: Соловйов М, Естевес М.П., ​​Амірі F, Кромптон МР, Rider CC (2013) Підвищена транскрипція гена QSOX1, що кодує Квієсцин Q6 сульфгідрилоксидазу 1 при раку молочної залози. PLoS ONE 8 (2): e57327. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057327

Редактор: Джун Лі, медична школа університету Сунь Ятсен, Китай

Отримано: 16 вересня 2012 р .; Прийнято: 21 січня 2013 р .; Опубліковано: 27 лютого 2013 р

Фінансування: Автори не мають підтримки чи фінансування для звітування.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Добре встановлено, що рука хромосоми 1q підлягає ампліфікації на рівні ДНК приблизно у 50–60% випадків раку молочної залози [1] - [3]. Незважаючи на те, що це не єдина ампліфікація хромосом при цьому захворюванні, вона є однією з найбільших і найпоширеніших, і її трактують як ранню подію канцерогенезу молочної залози [1]. Оцінки розміру та кількості задіяних окремих ампліконів різняться, але нещодавніші порівняльні дослідження геномної гібридизації з високою роздільною здатністю показали, що, хоча весь q-рукав може бути посилений, області 1q21.1–1q31.1 та 1q32.1–1q44 є найбільш часто постраждалі [4], [5]. На відміну від 1q, рука 1p демонструє незначне посилення, часто втрачаючи номер копії [1], [3] - [5]. Однак функціональне значення ампліфікації гена 1q залишається невідомим. Як і слід було очікувати, кількість копій генів пов'язана з надмірною експресією мРНК в тканині раку молочної залози, але кореляція тут менш повна. Дослідження мікрочастин кДНК показало, що 44% високоампліфікованих генів сильно гіперекспресовані при раку молочної залози, але так само 6% генів при нормальній кількості копій [6].

Оскільки ціле плече 1q підлягає ампліфікації генів, ми припустили, що картографування багатьох генів у цій геномній області є важливим для пухлинного раку молочної залози та/або прогресування. Однак на сьогоднішній день ми знаємо, що лише два гени 1q, COX2 [7], [8] та пероксиредоксин-6/PRDX6 [9], виявились надмірно вираженими при раку молочної залози і відігравали ключову роль у метастазуванні та виживанні ракових клітин. . Подальший ген 1q, нектин-4/PVRL4, як відомо, надмірно експресується, проте патологічне значення цього поки що незрозуміле [10]. Для того, щоб дослідити, чи можуть бути надмірно експресовані додаткові гени 1q при раку молочної залози, ми проаналізували їх рівень мРНК у нормальній та раковій тканині молочної залози, використовуючи серійний аналіз експресії генів (SAGE) та даних EST, зібраних у Проекті анатомії геному раку (http: // cgap.nci.nih.gov). Результати цих аналізів виявляють, що кілька генів демонструють особливо високий рівень надмірної експресії, включаючи QSOX1 (NM_002826), який кодує фермент квієцин Q6 сульфгідрил-оксидазу 1. Цей фермент належить до сімейства флавін-аденинінуклеотидів (FAD) - залежних сульфгідрил-оксидаз [11].

Ми підтвердили свої результати біоінформатики для QSOX1 експериментально, шляхом проведення RT-PCR, 3′RACE PCR та кількісної ПЛР у реальному часі. Ми виявили нову розширену 3'UTR-форму транскрипту QSOX1 і показали, що ген справді надмірно експресується при раку молочної залози з поганим прогнозом. Наші дані визначають QSOX1 як ген, вартий подальшого детального дослідження, щоб визначити його значимість у патогенезі та прогресуванні цієї хвороби.

Результати

Надмірне вираження та 3 ′ розширення стенограм QSOX 1 при раку молочної залози

Для того, щоб дослідити, чи часта ампліфікація генів q плеча хромосоми 1 може бути пов'язана з надмірною експресією генів, розташованих у цій області, ми дослідили пару відповідних бібліотек SAGE за допомогою інструменту DGED. Дані SAGE показали, що 156 генів гена 1q піддаються транскрипційній регуляції в протоці карциноми молочної залози порівняно з нормальною тканиною молочної залози. Збільшення регуляції приблизно однієї третини цих генів було визнано значним (P≤0,05), а 25 з цих генів демонструють надзвичайно значну підвищену регуляцію (P≤0,01). Останні надрегульовані гени наведені в таблиці 1 в порядку найвищого ступеня їх надмірної експресії при раку молочної залози; гени з (0,01

Панель A показує ампліфіковану кДНК з використанням праймерів 45-F і 46-R (очікувана довжина 550 п.н.). Панель B показує ампліфіковану кДНК з використанням праймерів 43-F і 44-R (очікувана довжина 735 bp). Інші ампліфікації ПЛР використовували праймери: 63-F з 64-R (панель C., очікуваний розмір 836 bp), 47-F з 48-R (панель D, очікуваний розмір 922 bp), 49-F з 50-R (панель Е, 825 bp), 53-F з 36-R (панель F, 883 bp), 23-F з 54-R (панель G, 620 п.н.). Панель H показана ампліфікована кДНК розчинної версії QSOX1 (QSOX1b) з використанням праймерів 17-F та 18-R (очікувана довжина 814 bp). Панель Я показує розмір фрагмента кДНК, посилений специфічним сенсорним праймером (106-Int-F) та антисмисловим 3 ′ RACE-адаптером-праймером (Adap-1-R). Специфічність ампліфікації (ідентичність усіх ампліфікованих продуктів ПЛР) була додатково підтверджена секвенуванням ДНК для всіх ампліфікованих продуктів.

Для того, щоб ідентифікувати фактичний 3 ′ кінець розширеної кДНК QSOX1, ми провели 3′-RACE-PCR, використовуючи набір вкладених конкретних праймерів та набір 3′-RACE адаптерів-праймерів (див. Додаткову таблицю S2 для послідовностей). Ампліфікована кДНК була виявлена ​​як смуга ∼300 bp, див. Малюнок 2, панель I, а 3'-кінець кДНК QSOX1 підтверджено секвенуванням. Кінець розширеної кДНК QSOX1 відповідає позиції 150651 геномної послідовності (AL390718), див. малюнок 1B. Ми також виявили типовий сигнал поліаденілювання AATAAA, розміщений приблизно в тридцяти нуклеотидах вище за послідовністю полі-А в кДНК (рис. 1В). Комбінація накладених RT-PCR, 3′-RACE-PCR та сигналу поліаденілювання однозначно підтвердила положення справжнього 3 ′ кінця кДНК QSOX1. Оскільки трансляція QSOX1 зупиняється всередині exon12, який містить стоп-кодон, то нещодавно ідентифіковане розширення є довгим некодуючим 3′UTR.

Кількісна ПЛР у реальному часі розшифровок транскриптів QSOX1 при раку молочної залози

Далі ми прагнули підтвердити експериментально як існування цього нового 3 ′ подовження мРНК QSOX1, так і підвищення рівня мРНК QSOX1 у тканині раку молочної залози. Отже, ПЛР у реальному часі проводили з використанням наборів зондів на основі кодуючої послідовності QSOX1 (CDS) (Набір 1) та на нещодавно ідентифікованому розширенні 3′UTR (Набори 2 та 3, див. Малюнок 1А). Була проведена скринінг групи зразків кДНК, підготовленої з хірургічно видаленої тканини молочної залози. Всі перевірені тканини виявили транскрипцію всіх трьох тестованих областей QSOX1, підтверджуючи, що мРНК QSOX1 існує у вигляді стенограми ∼6 кбіт, що набагато довше, ніж вважалося раніше. Експресія всіх трьох областей була низькою в нормальних тканинах та пухлинах 1 ступеня, але демонструвала підвищений рівень у зростаючій частці пухлин 2 та 3 ступеня, Малюнок 3A – C. Непараметричний статистичний аналіз за всіма чотирма клінічними класифікаціями показав коефіцієнт кореляції Спірмена 0,53 між відносним рівнем транскрипту та клінічною оцінкою, значення значне на рівні р 0,01. З 15 досліджених пухлин 3 ступеня експресія в 10 зразках перевищувала верхню межу норми (середнє +2 стандартні відхилення) для кожного набору праймерів.

Наведені дані для трьох різних наборів зондів TaqMan (панелі A-C). У всіх панелях вертикальна вісь є релевантною кількістю, нормованою до рівнів рРНК 18 с. В: Набір праймерів 1 (на основі QSOS1 CDS). B: Набір праймерів 2 (на основі QSOX1 3′UTR). C: Набір праймерів 3 (на основі QSOX1 3′UTR). Горизонтальна лінія на кожній точковій діаграмі показує середні дані виразів для кожного набору зондів/умови D: Діаграма розсіювання для даних набору 2 проти набору 1 для всіх препаратів. E: Розсіяний графік для даних набору 3 проти набору 2 для всіх препаратів. F: Розсіяний графік для набору 1 проти набору 3 для всіх препаратів. Для всіх графіків розсіювання всі осі показують відповідні значення достатку для відповідного зонда, встановленого в логарифмічній шкалі. Найкраще підходить лінійна регресія відображається пунктирною діагональною лінією.

З 41 пацієнта, у яких препарати кДНК піддавались ПЛР-аналізу в реальному часі, у 25 пухлини класифікували як протокові (середній відносний рівень розшифровки, 3,21), а 9 - лобулярні (середнє значення 1,364). Решта 7 пацієнтів були розподілені між змішаною (4), муцинозною (2) та крибриформною (1) патологічними класифікаціями. Для результатів, отриманих за допомогою набору 1, показаного на рис. 2А, двосторонніми t-тестами встановлена ​​різниця значущості між середнім середнім показником та середнім значенням протокової пухлини (p = 0,00148), а також між середнім значенням протокової та лобулярної (p = 0,120). Однак не було значущих відмінностей середніх значень для нормальної тканини та часточкової пухлини (p = 0,112).

Кореляція рівнів експресії окремих областей (набори зондів 1, 2 і 3) в окремих зразках тканини показала деякі відмінності в ступені розсіювання між сигналами, виміряними зондом 1-го набору (QSOX1 CDS), та будь-яким зондів 2-го або 3-го зондів, обидва з яких знаходяться в межах нещодавно визначеного розширеного QSOX1 3′UTR, (див. малюнок 3D – F). Це ще більше підвищує можливість того, що можуть відбутися альтернативні події сплайсингу, щоб пояснити ступінь мінливості у вираженні різних областей стенограми. При нормалізації щодо експресії в нормальній тканині молочної залози дані показали, що QSOX1 CDS експресує на відносно вищих рівнях раку 1 ступеня порівняно з рівнем експресії QSOX1 довгих 3'UTR (як зонди 2, так і 3), але тенденція виявляється зворотним при раках 2 та 3 ступеня (рис. 4).

Наведені дані середнього виразу (як на малюнку 2A-C) для трьох різних наборів зондів TaqMan, нормовані на середні дані виразу для набору 1 зонда. Набори 2 та 3 (3′UTR-область QSOX1) демонструють нижчий ступінь експресії у пухлинах 1 ступеня та вищий ступінь вираженості пухлин 3 ступеня щодо набору 1 (QSOX1 CDS).

Ми спробували експериментально ідентифікувати будь-які альтернативно зрощені транскрипти QSOX1, які могли б сприяти вищезазначеним спостереженням, за допомогою ПЛР-ампліфікації кДНК, отриманої з клітин карциноми T47D, за допомогою пар праймерів, розроблених навколо всіх відомих та передбачуваних варіантів сплайсингу. Ми не виявили жодних подальших альтернативно зрощених варіантів, крім раніше повідомлених форм QSOX1a та QSOX1b (остання кодує розчинні форми білка [12] та розширений 3′-UTR, про який повідомлялося вище.

Показані екзони QSOX1. В якості альтернативи з’єднані варіанти QSOX1a та QSOX1b базуються на NM_002826 та NM_001004128 відповідно. Інші альтернативні варіанти сплайсингу базуються на даних відображення EST (див. Таблицю 2) і називаються QSOX1c - QSOX1i для узгодження з раніше використовуваною номенклатурою. Визначені місця зрощування показані жирними сполучними лініями. Екзон 12b позначає фрагмент послідовності, який відсутній у коротшій альтернативно зрощеній версії QSOX1b.

Білкові домени QSOX1 Trx1, Trx2, HRR та ARV/ALR показані у вигляді світло-сірих затінених квадратів. Зірочки та вертикальні жовті лінії вказують на положення пар цистеїну у добутку стенограми QSOX1. SP (чорні ящики) позначає сигнальний пептид, ТМ позначає трансмембранний домен, а С позначає кінцевий С. Квадратні пунктирні горизонтальні лінії означають приєднання усічених доменів. Вилуплені коробки показують амінокислотні послідовності, що утворюються там, де таке приєднання призводить до зсуву кадрів.

Обговорення

Раніше лише два альтернативні варіанти ферменту, отримані від сплайсингу, були зареєстровані в тканинах людини, миші та щурів (NM_002826 та NM_001004128 послідовності людини, що кодують коротку та довгу мРНК відповідно). Останній кодує мембранний якірний білок, що міститься в Гольджі, секреторних гранулах та в ендоплазматичній сітці [28], [29]. Коротша версія мРНК QSOX1 виробляється альтернативною подією сплайсингу, за допомогою якої 733 базовий фрагмент видаляється із середини екзона 12, в результаті чого усічений білок QSOX1 відсутній у трансмембранному домені, і це кодує секретовану ізоформу [12], [30]. Поширений 3′UTR, про який повідомляється тут, схоже, не кодує альтернативну білкову послідовність. Швидше за все, він бере участь у посттранскрипційному регулюванні трансляції мРНК QSOX1 та експорту ядерної мРНК, розщепленні та поліаденілюванні. 3'UTR вважаються життєво важливими для стабільності транскриптів та регулювання експресії генів, таких як трансляційна репресія, опосередкована РНК-зв'язуючими білками та мікроРНК [31] - [33]. Повідомлене тут розширення QSOX1 3′UTR може брати участь у регулюванні стабільності стенограми QSOX1 і може пояснити спостережувану мінливість у видимих ​​рівнях QSOX1 CDS проти 3′UTR регіонів.

Наш систематичний аналіз баз даних EST виявив вісім передбачуваних нових варіантів сплайсингу QSOX1. З цих трьох варіантів послідовностей QSOX1c, d та e мають внутрішню делецію в кадрі, яка повністю або частково зберігає первинну структуру двох основних відомих функціональних доменів білка: PDI-подібного домену оксидоредуктази тіоредоксину Trx1 та FAD - залежний домен сульфгідрил-оксидази ERV/ALR [34] - [37]. Домен тіоредоксину, Trx2, і HRR області, багатої спіраллю, видаляються з усіх варіантів, крім QSOX1c. Утримання основних функціональних доменів білка та усіх окисно-відновних-активних дисульфідів в ізоформах QSOX1c, d, e може зберегти основну функцію ферменту - окислення сульфгідрильних груп до дисульфідів за рахунок відновлення кисню до перекису водню. Це припущення узгоджується з нещодавно опублікованими функціональними дослідженнями фрагментів QSOX1, які вказували на важливість взаємодії доменів Trx та ERV/ALR для тіоло-окислювальної активності білка QSOX1 [37], [38]. У продуктах решти варіантів сплайсингу (QSOX1f-i) бракує всіх, крім N-кінцевого фрагмента домену Trx1, і, швидше за все, є дисфункціональними білками.

Квієсцин Q6 міститься як в ендоплазматичному ретикулумі/апараті Гольджі, так і у вигляді секретується білка [12]. Це подвійне розташування разом із активністю щодо розгорнутих поліпептидів передбачає функції як первинного згортання секретованих білків, так і їх ремоделювання, як тільки вони досягнуть клітинної поверхні та позаклітинного матриксу. Остання діяльність може бути пов’язана з передачею сигналів, міграцією та метастазуванням ракових клітин. У цьому контексті доречно, що на недавньому генетичному скринінгу кДНК, що шукає транскрипти, здатні сприяти метастазуванню клітинної лінії раку молочної залози 168FARN, тіол-ізомераза ERp5 була визначена як сприяюча міграції та інвазії пухлинних клітин і як регульована в інвазивних клінічних зразках раку молочної залози [44]. Разом з нашими висновками виявляється, що клітинні механізми утворення відповідних дисульфідних зв'язків у секретованих білках є родючою областю дослідження при раку молочної залози з поганим прогнозом.

Методи

Аналіз даних виразів SAGE та EST

RT-PCR

Для посилення RT-PCR використовували градієнтний термоциклер Mastercycler (Eppendorf). Всі реакції збирали за допомогою набору REDTaq ReadyMix (Sigma-Aldrich). Умови ампліфікації включали початковий крок денатурації 1 хв при 96 ° C, після чого 30 циклів, кожен з яких складався з 30 с кроку денатурації при 96 ° C, 30 с кроку відпалу при (Tm − 7 ° C) і 1 хв розширення крок при 72 ° C, а остаточна інкубація 5 хв при 72 ° C. Послідовності праймерів наведені в додатковій таблиці S2. Всі ампліфіковані кДНК аналізували електрофорезом у 1,5% агарозних гелях. Всі кДНК очищали за допомогою набору для очищення ПЛР QIAquick (QIAGEN) і їх ідентичність підтверджували секвенуванням (GATC Biotech).

3′-RACE ПЛР

ПЛР у реальному часі

Довідкова інформація

Рисунок S1.

Розсіяний сюжет показує відсутність кореляції між ними QSOX1 і вираз ESR1 або HER2. Горизонтальна вісь - дані виразу SAGE для ESR1 або HER2, виражені як журнал повідомлених підрахунків SAGE. Вертикальна вісь - рахунок QSOX1 SAGE, шкала журналу. QSOX1 проти HER2 (заповнені кола), QSOX1 проти ESR1 (відкриті кола). Дані виразу не показують суттєвої кореляції. Коефіцієнт кореляції Пірсона, розрахований для бібліотек, де були виявлені як ESR1, так і QSOX1, становив -0,06, і -0,03 для HER2 та QSOX1.

Таблиця S1.

Посилена регуляція експресії генів 1q в протоці карциноми молочної залози

Таблиця S2.

Нуклеотидні послідовності праймерів, що використовуються для всіх ампліфікацій ПЛР.

Подяка

Ми вдячні Керолайн Дж. Пеннінгтон та Ділану Р. Едвардсу, Школа біологічних наук, Університет Східної Англії, Великобританія, за проведення досліджень qPCR.

Внески автора

Координував дослідження: MS MRC CCR. Прочитав і затвердив остаточний рукопис: MS MPE FA MRC CCR. Задумав і спроектував експерименти: MS. Виконували експерименти: MS MPE FA. Проаналізовано дані: MS MPE FA. Реагенти/матеріали/інструменти для аналізу, внесені: MS MRC CCR. Написав папір: MS CCR.