Оцінка вмісту метіоніну у дієті з високим вмістом жиру та холіну щодо збільшення маси тіла та розвитку неалкогольного стеатогепатиту у мишей

Інформаційний центр афілійованих осіб, Національний інститут охорони здоров'я та харчування, Національний інститут біомедичних інновацій, охорони здоров'я та харчування, Сінджуку-ку, Токіо, Японія

метіоніну

Інформаційний центр афілійованих осіб, Національний інститут охорони здоров'я та харчування, Національний інститут біомедичних інновацій, охорони здоров'я та харчування, Сінджуку-ку, Токіо, Японія

Інформаційний центр афілійованих осіб, Національний інститут охорони здоров'я та харчування, Національний інститут біомедичних інновацій, охорони здоров'я та харчування, Сінджуку-ку, Токіо, Японія

Афілійований відділ харчової науки та харчування, Аграрний факультет Університету Кінкі, Накамачі, Нара, Японія

Інформаційний центр афілійованих осіб, Національний інститут охорони здоров'я та харчування, Національний інститут біомедичних інновацій, охорони здоров'я та харчування, Сінджуку-ку, Токіо, Японія

  • Цуйосі Чіба,
  • Sachina Suzuki,
  • Йоко Сато,
  • Тацукі Ітох,
  • Кейдзо Умегакі

Цифри

Анотація

Безалкогольний стеатогепатит (NASH) - це загальновизнане захворювання печінки. Дієта з дефіцитом метіоніну та холіну використовується для індукування NASH у мишей; однак ця дієта також спричиняє сильну втрату маси тіла. Щоб вирішити цю проблему, ми вивчили вплив вмісту метіоніну у дієті з високим вмістом жиру та дефіциту холіну (HFCD) на масу тіла та розвиток NASH у мишей.

Методи

Мишей C57BL/6J (самці віком 10 тижнів) годували дієтою для гризунів L-амінокислот (контроль), дієтою з високим вмістом жиру (HF) або дієтою HFCD, що містить різну кількість метіоніну (0,1-0,6% (мас./Мас.) )) протягом 12 тижнів. Вимірювали рівні ліпідів у плазмі крові, вміст ліпідів у печінці та експресію гена маркера запалення та проводили патологічний аналіз для оцінки NASH.

Результати

0,1% метіоніну в дієті з HFCD пригнічував приріст маси тіла, який був нижчим, ніж при контрольній дієті. З іншого боку, 0,2% метіоніну в дієті з HFCD дало подібний приріст маси тіла, як контрольна дієта, тоді як більше 0,4% метіоніну показало такі ж прирости маси тіла, як і дієта HFCD. Вага печінки та вміст ліпідів у печінці були найбільшими при 0,1% метіоніну та зменшувались залежно від дози метіоніну. Патологічний аналіз, показники активності NAFLD та рівні експресії генів у печінці показали, що 0,1% та 0,2% метіоніну протягом 12 тижнів індукували NASH, тоді як 0,4% та 0,6% метіоніну послаблювали індукцію NASH дієтою HFCD. Однак 0,2% метіоніну в дієті з HFCD не викликав інсулінорезистентності, незважаючи на збільшення маси тіла.

Висновки

0,2% метіоніну в дієті з HFCD протягом 12 тижнів був здатний викликати NASH без втрати ваги.

Цитування: Chiba T, Suzuki S, Sato Y, Itoh T, Umegaki K (2016) Оцінка вмісту метіоніну у дієті з високим вмістом жиру та холіну щодо збільшення маси тіла та розвитку неалкогольного стеатогепатиту у мишей. PLoS ONE 11 (10): e0164191. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0164191

Редактор: Джованні Лі Волті, Університет Катанії, ІТАЛІЯ

Отримано: 20 травня 2016 р .; Прийнято: 21 вересня 2016 р .; Опубліковано: 10 жовтня 2016 р

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Фінансування: Автори не отримали конкретного фінансування для цієї роботи.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) та більш прогресуючий безалкогольний стеатогепатит (НАСГ) нещодавно стали визнаними захворюваннями печінки у розвинених країнах [1]. Поширеність НАЖХП зросла не лише в західних країнах, а й в Азії [2] та Японії [3, 4]. Крім того, у 10–15% хворих на НАЖХП діагностовано НАСГ [5], який може прогресувати від стеатозу та фіброзу до цирозу та гепатоцелюлярної карциноми [6, 7]. NASH характеризується результатами біопсії печінки, що спостерігаються при алкогольному гепатиті, на додаток до підвищених плазмових показників ураження печінки та накопичення ліпідів у печінці при НАЖХП. У людини NASH асоціюється із ожирінням та метаболічним синдромом, таким як інсулінорезистентність, цукровий діабет та дисліпідемія [8, 9]. В даний час не існує встановленої фармакотерапії NASH; тому в даний час тривають дослідження на тваринах. Однак, хоча повідомляється про кілька моделей тварин NASH [10, 11], оптимальної моделі тварин NASH людини не існує.

Оскільки кожна дієта має переваги та недоліки, ми спробували визначити дієту, яка викликає патологію НАСГ без втрати ваги. У цьому дослідженні мишей C57BL/6 годували дієтою з високим вмістом жиру та дефіцитом холіну (HFCD), що містить кілька доз метіоніну, протягом 12 тижнів, а також оцінювали збільшення маси тіла та прогресування НАСГ у мишей. Більше 0,2% метіоніну в дієті з HFCD було необхідним для збільшення маси тіла, а менше 0,2% метіоніну в дієті з HFCD могло викликати NASH через 12 тижнів у мишей.

Матеріали і методи

Тварини та експериментальний дизайн

Самці мишей C57BL/6J (віком 9 тижнів) були придбані у CLEA Japan Inc. (Токіо, Японія). Після 1 тижня аклімації мишей (віком 10 тижнів) годували дієтою для гризунів L-амінокислот (контроль), дієтою з високим вмістом жиру (HF) або дієтою HFCD, що містила різну кількість метіоніну (0,1-0,6% (мас. ш)). Рівень 0,6% метіоніну такий самий, як у контрольній та СН-дієтах. Точні склади кожної дієти наведені в таблиці S1. Ці дієти були придбані у Research Diet Inc. (Нью-Брансвік, Нью-Джерсі). Мишей утримували в клітках (менше 5 мишей у кожній клітці) з 12-годинним циклом світло/темрява, і їм давали їжу та воду за бажанням. Всі експерименти на тваринах проводились із схвалення Національного інституту біомедичних інновацій, охорони здоров’я та харчування Комітету з етики тварин (№ 1413).

Хімія плазми

Після 8 або 12 тижнів годування мишей голодували протягом ночі і вбивали під наркозом із ізофлураном. Зразки крові отримували із серця, а зразки плазми готували негайно. Рівні загального холестерину в плазмі (TC), TG, неестерифікованих жирних кислот (NEFA), глюкози та функціональних маркерів печінки (GOT, GPT та лужна фосфатаза (ALP)) вимірювали за допомогою ферментативних методів (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan ). Рівні інсуліну в плазмі крові вимірювали за допомогою набору ELISA для ультрачутливого мишачого інсуліну Mercodia (Mercodia, Упсала, Швеція).

Вимірювання вмісту печінкових ліпідів

Печінкові ліпіди екстрагували хлороформом/метанолом (2: 1) методом Фолча [21]. Печінку (приблизно 100 мг) гомогенізували в 6 мл хлороформу/метанолу (2: 1) за допомогою гомогенізатора політрону. Ліпіди екстрагували інкубацією протягом ночі, фільтрували для видалення нерозчинних залишків та доводять до 10 мл хлороформом/метанолом. По одному мілілітру кожного зразка додавали в мікропробірку і органічний розчинник випаровували. Залишок розчиняли в ізопропанолі (з 10% Тритон-Х). Вміст TC, TG та NEFA вимірювали за допомогою ферментативних методів (Wako Pure Chemical Industries).

Гістологічне дослідження

Печінку видаляли і частину кожної печінки негайно фіксували 10% забуференним розчином формаліну. Зразки печінки вбудовували в парафін і розрізали на товщину 3 мкм для фарбування гематоксиліном та еозином (ВІН) та червоним сиріусом. Показники активності НАЖХП визначали за оцінками стеатозу, часткового запалення та балонізації гепатоцитів. Також вимірювали площу фіброзу. Патологічні особливості стеатозу (0–3), часткового запалення (0–3), балонізації гепатоцитів (0–2) та фіброзу (0–4) були оцінені компанією Allisere, Inc. (Токіо, Японія). Мишам з оцінкою активності NAFLD більше 5 було поставлено діагноз "NASH", від 5 до 3 як "прикордонний" і менше 3 як "не NASH" [22]. Імунофарбування F4/80 проводили антитілом F4/80 щуря (A3-1; BIO-RAD Laboratories, Inc., Геркулес, Каліфорнія) як первинного антитіла, кролик-поліклональний щурячий IgG-важкий та легкий ланцюговий схрещування -абсорбоване антитіло (A110-322A; BETHYL Laboratories, Inc., Montgomery, TX) як вторинне антитіло та система виявлення полімерного очищення BOND (LEICA Biosystems, Nussloch, Німеччина).

Кількісна RT-PCR

Загальну РНК екстрагували з печінки за допомогою системи очищення РНК TRIzol Plus (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія) та реверсували транскрипцією за допомогою PrimeScript RT Master Mix (Takara Bio Inc., Shiga, Японія). Кількісну RT-PCR проводили в 96-лункових планшетах із SYBR Green PCR Master Mix та системою Thermal Cycler Dice Real Time Single (Takara Bio Inc.). Кількості копій для кожного гена визначали методом абсолютного кількісного визначення з використанням серійно розведених стандартів відомих концентрацій. Результати виражаються як відношення кількості копій цільової мРНК до мРНК GAPDH. Пари праймерів, специфічні для мишей, використані в цьому експерименті, показані в таблиці S2.

Внутрішньочеревинний тест на толерантність до глюкози

Після нічного голодування розчин D-глюкози (2 г/кг ТБ) вводили внутрішньочеревно. Контролю давали фізрозчин. Рівні глюкози в крові контролювали за допомогою хвісткової кровотечі до введення глюкози (0 хв.) Та через 15, 30, 60, 120 та 180 хв. Після ін’єкції глюкози за допомогою Breeze2 (Bayer Pharma AG, Берлін, Німеччина).

Статистичний аналіз

Дані представлені як середні значення ± SEM. Порівняння даних з кількох груп проводили одностороннім ANOVA з пост-хок-тестом Бонферроні (SPSS 18.0J для Windows; IBM Co., Armonk, NY). Порівняння даних між двома групами проводили за допомогою непарного t-критерію Стьюдента (PASW Statistics Base 18; IBM). Значення P Таблиця 1. Вага тіла, маса тканин і біомаркерів плазми (8 тижнів).

12-тижневе годування

Пригнічений HFCD приріст маси тіла та індуковане пошкодження печінки послаблювались залежно від дози метіоніну.

Мишей C57BL/6J (самці віком 10 тижнів) протягом 12 тижнів годували контрольною дієтою, високочастотною дієтою або дієтою з високим вмістом клітин, що містить 0,1%, 0,2%, 0,4% або 0,6% метіоніну. Після нічного голодування мишей вбивали, а печінку видаляли. Печінкові ліпіди витягували за методом Фолча, а рівні TC, TG та NEFA вимірювали за допомогою ферментативних методів. * P Таблиця 3. Вага тіла, маса тканин і плазмові біомаркери (12 тижнів).

Експресія гена маркера запалення та фіброзу, індукованого HFCD, ослаблена дозозалежним чином метіоніну.

Мишей C57BL/6J (самці віком 10 тижнів) годували кожною експериментальною дієтою протягом 12 тижнів. Загальну РНК витягували з печінки, а рівні експресії (А) транскрипційних факторів, (В) генів, пов’язаних із синтазою жирних кислот, (С) генів, пов’язаних із запаленням, та (Д) генів, пов’язаних з фіброзом, вимірювали за допомогою RT- Методи ПЛР. Дані представлені як середні показники та SEM, n = 7 або 8 у кожному раціоні. * P Рис. 3. Патологічний аналіз.

Мишей C57BL/6J (самці віком 10 тижнів) годували кожною експериментальною дієтою протягом 12 тижнів. Після нічного голодування мишей вбивали, а печінку видаляли. (А) Проведено патологічний аналіз з фарбуванням ВІН, серійним червоним фарбуванням та імунним фарбуванням F4/80. Стовпчик вказує на 100 мкм. Оригінальне збільшення x200. (B) Показник фіброзу визначали як відношення червоно-позитивної площі сиріуса до всієї площі в кожному зрізі. Дані представлені як середні показники та SEM, n = 7 або 8 у кожному раціоні. *** P Таблиця 4. Оцінка активності NAFLD (12 тижнів).

0,2% метіоніну в дієті з HFCD не викликало непереносимості глюкози.

Миші, які годували 0,2% метіоніну в дієті з HFCD протягом 12 тижнів, розвивали патологію NASH без придушення збільшення маси тіла. Таким чином, ми проводили ІПГТТ на мишах, які годували 0,2% метіоніну в дієті HFCD протягом 12 тижнів. Однак не спостерігали суттєвих відмінностей у рівнях IPGTT, AUC або інсуліну в плазмі між мишами, які годували контрольну дієту, та тими, хто отримував 0,2% метіоніну в дієті з HFCD (рис. Ці результати дозволяють припустити, що 0,2% метіоніну в дієті з HFCD не викликав непереносимості глюкози, подібно до дієти MCD, навіть незважаючи на те, що спостерігалося збільшення маси тіла.

Мишей C57BL/6J (самці віком 10 тижнів) годували контрольною дієтою або 0,2% метіоніну в дієті з HFCD протягом 12 тижнів, а IPGTT проводили після нічного голодування. (A) Після ін’єкції глюкози (2 г/кг т. Д., Внутрішньовенно), рівні глюкози в плазмі вимірювали в кожну точку часу. (B) AUC розраховували в (A). (C) Рівень інсуліну в плазмі крові вимірювали за допомогою набору ELISA. n = 6 у кожній дієті.

Обговорення

Найбільш часто використовувана дієта для індукування НАСГ у гризунів - це дієта МЦД; однак це спричиняє сильну втрату ваги, яка відрізняється від людської NASH. Попереднє дослідження продемонструвало, що дефіцит метіоніну та холіну спричиняє втрату ваги навіть при високотемпературній дієті [15]. Щоб подолати цю проблему, ми дослідили вплив добавок метіоніну дієтою HFCD на масу тіла та патологію NASH. У цьому дослідженні маса тіла у мишей, які отримували 0,1% метіоніну при дієті з HFCD, була нижчою, ніж у мишей, які отримували контрольну дієту, тоді як більш ніж 0,2% метіоніну викликало збільшення маси тіла. Більше 0,4% метіоніну протягом 12 тижнів може спричинити ожиріння, але не патологію NASH. Отже, 0,2% метіоніну в дієті з HFCD протягом 12 тижнів придатний для індукування НАСГ без зменшення маси тіла у мишей.

PPARα є важливим фактором транскрипції в NASH. Рівні експресії мРНК PPARα були значно нижчими у мишей, які годували 0,1% метіоніном у дієті HFCD, і зростали залежно від дози метіоніну. Дієта MCD індукувала печінкове накопичення ліпідів, не тільки запобігаючи синтезу та секреції ЛПНЩ з печінки, але також запобігаючи β-окисленню FFA в печінці. PPARα також має протизапальну властивість. Попереднє дослідження повідомляло, що активація NFκB та PPARα взаємно регулюється білково-білковими взаємодіями [29]; тому запалення, індуковане дієтою MCD, може пригнічувати експресію мРНК PPARα шляхом активації NFκB. Wy14,643, агоніст гена PPARα, покращив стеатоз та балонізацію у діабетичних мишей моделі NASH [30], а також подвійний агоніст PPARα/δ надав захист печінки на стеатоз, запалення та фіброз у кількох моделях гризунів [31]. У людини експресія гена PPARα в печінці негативно корелює із ступенем тяжкості NASH [32]. Тому PPARα викликає інтерес як терапевтична мішень для НАЖХП/НАСГ [33, 34].

ВЧ-дієти, що містять транс-жирні кислоти, також використовуються для індукування НАСГ на моделях мишей [19, 20]. Крім того, холестерин та холат викликали не тільки ліпотоксичність печінки, але також втрату ваги та зменшення жирової тканини, хоча ця дієта містила 60% жиру [18]. Однак однією з наших цілей є створення дієти, що індукує НАСГ, якомога подібнішої до дієти людини. Тому ми не додавали транс-жирні кислоти, холестерин або холат натрію до досліджуваних дієт. ВЧ-дієта, яка викликає ожиріння, зазвичай містить 45–60% енергії з жиру, але 60% енергії з жиру в раціоні нетипово для людей, навіть у західних країнах, і ми вважали, що 46% енергії від жиру в нашому раціоні є достатньо, щоб викликати ожиріння. З іншого боку, дієта MCD містить лише 20% енергії з жиру, і ця дієта зменшує масу тіла та масу жирової тканини. Для того, щоб створити модель NASH без втрати ваги, нам потрібно поєднати особливості дієт HF та MCD.

Висновки

Результати цього дослідження показали, що для дієти з HFCD потрібно мінімум 0,2% метіоніну, щоб миші набирали масу тіла. З іншого боку, пошкодження печінки, спричинене дієтою HFCD, послаблювалось залежно від дози метіоніну, а менше ніж 0,2% метіоніну індукувало патологію NASH у мишей через 12 тижнів. 0,2% метіоніну в дієті з HFCD протягом 12 тижнів був здатний викликати NASH без втрати ваги.

Довідкова інформація

S1 Рис. Попереднє дослідження впливу метіоніну в дієті з HFCD на масу тіла та прогресування НАСГ.