Напівсинтетичний організм з розширеним генетичним алфавітом

Предмети

Анотація

Параметри доступу

Підпишіться на журнал

Отримайте повний доступ до журналу протягом 1 року

лише 3,58 € за випуск

Усі ціни вказані у нетто-цінах.
ПДВ буде додано пізніше під час оплати.

Оренда або купівля статті

Отримайте обмежений за часом або повний доступ до статей на ReadCube.

Усі ціни вказані у нетто-цінах.

Список літератури

Малишев, Д. А. та ін. Ефективна та незалежна від послідовності реплікація ДНК, що містить третю пару основ, створює функціональний генетичний алфавіт із шести літер. Proc. Natl Акад. Наук. США 109, 12005–12010 (2012)

Ян, З., Чен, Ф., Альварадо, Дж. Б. і Беннер, С. А. Ампліфікація, мутація та секвенування синтетичної генетичної системи із шести літер. J. Am. Хім. Соц. 133, 15105–15112 (2011)

Ямасіге, Р. та ін. Високоспецифічні неприродні системи пар основ як третя пара основ для ампліфікації ПЛР. Нуклеїнові кислоти Res. 40, 2793–2806 (2012)

Seo, Y. J., Malyshev, D. A., Lavergne, T., Ordoukhanian, P. & Romesberg, F. E. Сайтове маркування ДНК і РНК з використанням ефективно відтвореного та транскрибованого класу неприродних пар основ. J. Am. Хім. Соц. 133, 19878–19888 (2011)

Seo, Y. J., Matsuda, S. & Romesberg, F. E. Транскрипція розширеного генетичного алфавіту. J. Am. Хім. Соц. 131, 5046–5047 (2009)

Betz, K. та співавт. Структурні уявлення про реплікацію ДНК без водневих зв’язків. J. Am. Хім. Соц. 135, 18637–18643 (2013)

Betz, K. та співавт. Полімераза KlenTaq копіює неприродні пари основ шляхом індукції геометрії Ватсона – Крика. Nature Chem. Біол. 8, 612–614 (2012)

Ву, Ю., Фа, М., Тае, Е. Л., Шульц, П. Г. та Ромесберг, Ф. Е. Ферментативне фосфорилювання неприродних нуклеозидів. J. Am. Хім. Соц. 124, 14626–14630 (2002)

Ян, Х. і Цай, М. Д. Нуклеозидні монофосфатні кінази: структура, механізм та специфічність субстрату. Адв. Ензимол. 73, 103–134 (1999)

Winkler, H. H. & Neuhaus, H. E. Немітохондріальний транспорт АТФ. Тенденції Biochem. Наук. 24, 64–68 (1999)

Амірі, Х., Карлберг, О. та Андерссон, С. Г. Глибоке походження транслокад ATP/ADP пластид/паразитів. J. Mol. Евол. 56, 137–150 (2003)

Хетч, Т. П., Аль-Хоссейні, Е. та Сільверман, Дж. А. Транспорт нуклеотидів аденину та лізину в Хламідіоз пситтаці. Дж. Бактеріол. 150, 662–670 (1982)

Вінклер, Х. Х. Проникність Ріккетсія: транспортна система ADP-ATP. Дж. Біол. Хім. 251, 389–396 (1976)

Горн, М. і Вагнер, М. Бактеріальні ендосимбіонти вільноживучих амеб. Й. Еукаріот. Мікробіол. 51, 509–514 (2004)

Хаферкамп, І. та ін. Залучення нуклеотидного пулу господаря: нові нуклеотидні білки-носії Амебофіла протохламідії. Мол. Мікробіол. 60, 1534–1545 (2006)

Miroux, B. & Walker, J. E. Надмірне виробництво білків у кишкова паличка: мутант-господарі, які дозволяють синтезувати деякі мембранні білки та глобулярні білки на високому рівні. J. Mol. Біол. 260, 289–298 (1996)

Хаферкамп, І. та Лінка, Н. Функціональна експресія та характеристика мембранних транспортних білків. Рослинний біол. 14, 675–690 (2012)

Аст, М. та співавт. Діатомові пластиди залежать від імпорту нуклеотидів з цитозолю. Proc. Natl Акад. Наук. США 106, 3621–3626 (2009)

Баба, Т. та ін. Будівництво кишкова паличка K-12 в кадрі, одногенові мутантні нокаути: колекція Keio. Мол. Сист. Біол. 2, 2006.0008 (2006)

Лавернь Т., Малишев Д.А. & Ромесберг Ф.Е. Основні заступники канавок та розпізнавання полімерази класу переважно гідрофобних неприродних пар основ. Хімія 18, 1231–1239 (2012)

Seo, Y. J., Hwang, G. T., Ordoukhanian, P. & Romesberg, F. E. Оптимізація неприродної пари основ в напрямку природної реплікації. J. Am. Хім. Соц. 131, 3246–3252 (2009)

Лі, Л. та співавт. Природна реплікація неприродної пари основ для розширення застосувань генетичного алфавіту та біотехнологій. J. Am. Хім. Соц. 136, 826–829 (2014)

Tomizawa, J. & Selzer, G. Ініціювання синтезу ДНК у кишкова паличка. Анну. Преподобний Біохім. 48, 999–1034 (1979)

Аллен, Дж. М. та співавт. Ролі ДНК-полімерази I у реплікації провідного та відстаючого ланцюгів, що визначається слідом мутації високої роздільної здатності реплікації плазміди ColE1. Нуклеїнові кислоти Res. 39, 7020–7033 (2011)

Хашимото, Х. та співавт. Структура a Наеглерія Тет-подібна діоксигеназа в комплексі з 5-метилцитозиновою ДНК. Природа 506, 391–395 (2013)

Малишев, Д. А., Сео, Ю. Й., Ордуханян, П. та Ромесберг, Ф. Е. ПЛР із розширеним генетичним алфавітом. J. Am. Хім. Соц. 131, 14620–14621 (2009)

Хірао, І. та ін. Неприродна гідрофобна система пар основ: специфічне включення аналогів нуклеотидів до ДНК та РНК. Методи природи 3, 729–735 (2006)

Гудман, М. Ф. Схильні до помилок репараційні ДНК-полімерази у прокаріотів та еукаріотів. Анну. Преподобний Біохім. 71, 17–50 (2002)

Quan, J. & Tian, J. Циркулярне клонування розширення полімерази для високопродуктивного клонування складних та комбінаторних бібліотек ДНК. Природні протоколи 6, 242–251 (2011)

Ludwig, J. & Eckstein, F. Швидкий та ефективний синтез нуклеозидів 5′-0- (1-тіотрифосфатів), 5′-трифосфатів та 2 ’, 3′-циклофосфоротіоатів із використанням 2-хлор-4Н-1,3,2 -бензодіоксафосфорин-4-он. J. Org. Хім. 54, 631–635 (1989)

Alpert, A. & Shukla, A. Осадження великих білків із високим вмістом сировини з сироватки та органічних розчинників у ABRF 2003: Переклад біології з використанням протеоміки та функціональної геноміки Плакат № P111-W http://www.abrf.org/Other/ABRFMeetings/ABRF2003/Alpert.pdf (2003)

Кубічек, Х. Є. та Фріске, Дж. А. Визначення об'єму бактеріальних клітин за допомогою лічильника Коултера. Дж. Бактеріол. 168, 1466–1467 (1986)

Yanes, O., Tautenhahn, R., Patti, G. J. & Siuzdak, G. Розширення охоплення метаболомів для глобального профілювання метаболітів. Анальний Хім. 83, 2152–2161 (2011)

Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J. & Jessen, T. Введення плазмідної ДНК у клітини. Curr. Прот. Мол. Біол Глава 1, Розділ 1.8 (2001)

Knab, S., Mushak, T. M., Schmitz-Esser, S., Horn, M. & Haferkamp, I. Нуклеотидний паразитизм Simkania negevensis (Хламідії). Дж. Бактеріол. 193, 225–235 (2011)

Аудія, Дж. П. і Вінклер, Х. Х. Дослідження п’ятірок Rickettsia prowazekii білки, анотовані як ATP/ADP-транслокази (Tlc): Тільки Tlc1 транспортує ATP/ADP, тоді як Tlc4 і Tlc5 транспортують інші рибонуклеотиди. Дж. Бактеріол. 188, 6261–6268 (2006)

Hofer, A., Ekanem, J. T. & Thelander, L. Алостерична регуляція Trypanosoma brucei вивчали рибонуклеотидредуктазу в пробірці і в природних умовах. Дж. Біол. Хім. 273, 34098–34104 (1998)

Reijenga, J. C., Wes, J. H. & van Dongen, C. A. M. Порівняння процедур екстракції метанолу та хлорної кислоти для аналізу нуклеотидів за допомогою ізотахофорезу. Й. Хроматогр. Б Біомед. Наук. Заяв. 374, 162–169 (1986)

Подяка

Ми вдячні І. Хаферкамп і Дж. Аудії за те, що люб'язно надали плазміди NTT та допомогли обговорити справи, а П. Ордуханяну за те, що вони надали доступ до Центру досліджень білка та нуклеїнової кислоти при TSRI. Цю роботу підтримав Національний інститут охорони здоров’я США (NIH) (GM 060005).

Інформація про автора

Приналежності

Департамент хімії, Науково-дослідний інститут Скриппса, 10550 North Torrey Pines Road, Ла-Холла, Каліфорнія 92037, США

Денис А. Малишев, Кірандіп Дамі, Томас Лавернь, Тінджіян Чен і Флойд Е. Ромесберг

New England Biolabs, 240 County Road, Ipswich, 01938, штат Массачусетс, США

Нан Дай, Джеремі М. Фостер та Іван Р. Корреа

Ви також можете шукати цього автора в PubMed Google Scholar

Внески

D.A.M., K.D., T.C. та F.E.R. розробив експерименти. Д.А.М., К.Д. та Т.Л. проводили досліди. Н.Д., Дж.М.Ф. та I.R.C.J. виконали LC-MS/MS аналіз. Д.А.М., К.Д. та F.E.R. проаналізовані дані та D.A.M. та F.E.R. написав рукопис за сприяння інших авторів.

Відповідний автор

Декларації про етику

Конкуруючі інтереси

F.E.R. та D.A.M. подали заявку на патент, засновану на використанні НТТ для біотехнологічних застосувань. F.E.R. D.A.M., T.L. та К.Д. мати акції в компанії Synthorx Inc., яка має комерційні інтереси в UBP. Д.А.М. та К.Д. в даний час працюють у Synthorx Inc. Інші автори не заявляють про відсутність конкуруючих фінансових інтересів.

Розширені дані та таблиці

Розширені дані Рисунок 1 Поглинання природного трифосфату НТТ.

a, Обстеження специфічності субстрату (КM, μM) NTT, що аналізуються в цьому дослідженні. b, PtNTT2 значно активніше поглинає [α- 32 P] -dATP порівняно з іншими транспортерами нуклеотидів. Показані необроблені (ліворуч) та оброблені (праворуч) дані. Відносна радіоактивність відповідає загальній кількості підрахунків, отриманих кожною пробою. Цікаво, що обидва ПемNTT2 та ПемNTT5 демонструє помітне поглинання dATP, хоча про цю активність раніше не повідомлялося. Це можливо пояснити тим фактом, що специфічність субстрату характеризувалася лише за допомогою конкурентних експериментів, і чутливість аналізу могла бути недостатньою для виявлення цієї активності 15. На цьому малюнку наведено посилання 35, 36.

Розширені дані Рисунок 2 Деградація неприродних трифосфатів у середовищах зростання.

Ненатуральні трифосфати (3P) dNaM та d5SICS розкладаються до дифосфатів (2P), монофосфатів (1P) та нуклеозидів (0P) у зростаючій бактеріальній культурі. Фосфат калію (KPi) значно уповільнює дефосфорилювання обох неприродних трифосфатів. a, Репрезентативні сліди ВЕРХ (для області від ∼ 20 до 24 хв). Нуклеозиди dNaM та d5SICS елююються приблизно через 40 хв і не показані. b, Профілі композиції.

Розширені дані Рисунок 3 Вплив фосфату калію на поглинання dATP та стабільність у середовищах росту.

a, KPi інгібує поглинання [α- 32 P] -dATP при концентраціях вище 100 мМ. Показані необроблені (ліворуч) та оброблені (праворуч) дані. NTT від Rickettsia prowazekii (RpNTT2) не опосередковує поглинання жодного з dNTP і був використаний як негативний контроль: його фоновий сигнал віднімався від сигналу PtNTT2 (чорні смуги) та TpNTT2 (білі смуги). Відносна радіоактивність відповідає загальній кількості підрахунків, отриманих кожною пробою. b, KPi (50 мМ) значно стабілізує [α- 32 P] -dATP у середовищі. Стабільність трифосфату в середовищі не суттєво впливає на природу вираженого NTT. 3P, 2P та 1P відповідають трифосфатному, дифосфатному та монофосфатному станам відповідно. Бари помилок представляють s.d. середнього, n = 3.

Розширені дані Малюнок 4 Поглинання та ріст dATP, що експресують клітини PtNTT2 як функція концентрації індуктора (IPTG).

Криві росту та поглинання [α- 32 P] -dATP бактеріальними клітинами, трансформованими pCDF-1b-PtПлазміда NTT2 (pACS) як функція концентрації IPTG. a, Загальне поглинання радіоактивного субстрату (ліворуч) та загальний вміст внутрішньоклітинного трифосфату (праворуч) відображаються у два різні моменти часу. Відносна радіоактивність відповідає загальній кількості підрахунків, отриманих кожною пробою. b, Культуру стаціонарної фази клітин pACS C41 (DE3) розбавляли у 100 разів у свіжому середовищі 2 × YT, що містить 50 мМ KPi, стрептоміцину та IPTG у зазначених концентраціях, і вирощували при 37 ° C. Бари помилок представляють s.d. середнього, n = 3.

Розширені дані Рисунок 5 Стабільність та поглинання dATP у присутності 50 мМ KPi та 1 мМ IPTG.

Склад [α- 32 P] -dATP у середовищі (ліворуч) та фракція цитоплазми (праворуч) як функція часу. Зображення TLC та їх кількісні показники відображаються внизу та у верхній частині кожної з панелей відповідно. 3P, 2P та 1P відповідають нуклеозиду трифосфату, дифосфату та монофосфату відповідно. М відноситься до суміші всіх трьох сполук, яка була використана як стандарт TLC. Положення, позначене як «Старт», відповідає положенню плямистості зразків на пластині TLC.