Набір інструментів для вивчення функцій цитозольної неспецифічної дипептидази 2 (CNDP2) з використанням дрозофіли як модельного організму

Євгенія Н. Андрєєва

1 Інститут молекулярної та клітинної біології Сибірського відділення Російської академії наук, Новосибірськ, 630090 Росія

Ганна Олександрівна Огієнко

2 Новосибірський державний університет, Новосибірськ, 630090 Росія

Дубатолова Тетяна Д.

Анастасія Л. Ощепкова

3 Інститут хімічної біології та фундаментальної медицини Сибірського відділення Російської академії наук, Новосибірськ, 630090 Росія

Кожевникова Олена Миколаївна

Антон Васильович Іванкін

Павлова Гера Олександрівна

Сергій Олександрович Копил

Олексій Васильович Піндюрін

2 Новосибірський державний університет, Новосибірськ, 630090 Росія

Конференція

Пов’язані дані

Усі додаткові дані містяться в додаткових файлах. Матеріали, створені під час поточного дослідження, доступні у відповідних авторів за обґрунтованим запитом.

Анотація

Передумови

Експресія гена CNDP2 часто регулюється вгору або вниз при різних типах раку людини. Однак, як продукт цього гена бере участь у рості та розмноженні клітин, недостатньо вивчено. Більше того, наші знання про функції ортологів CNDP2 у добре відомих модельних організмів є дефіцитними. Зокрема, функція ортолога D. melanogaster CNDP2, кодованого геном CG17337 (далі - dCNDP2), досі невідома.

Результати

Це дослідження було спрямоване на розробку набору генетичних та молекулярних інструментів для вивчення ролі dCNDP2. Ми генерували нульову мутацію dCNDP2 (далі ∆dCNDP2), використовуючи CRISPR/Cas9-опосередковану гомологічну рекомбінацію (HR), і виявили, що мутанти CdCNDP2 є гомозиготними життєздатними, морфологічно нормальними та фертильними. Ми також генерували трансгенні мухолінії, що експресують білок dCNDP2 з міткою eGFP та без міток, все під контролем промотору UAS, а також поліклональні антитіла, специфічні для dCNDP2. Використовуючи ці інструменти, ми демонструємо, що лише одна з двох передбачених ізоформ dCNDP2 експресується в різних досліджуваних тканинах. dCNDP2 був виявлений як у цитоплазмі, так і в ядрі, і виявлено, що він пов'язаний з безліччю ділянок у політенових хромосомах слинної залози.

Висновки

Ген dCNDP2 не є важливим для життєздатності мух у стандартних лабораторних умовах. Характер субклітинної локалізації dCNDP2 свідчить про те, що цей білок може виконувати роль як у цитоплазмі, так і в ядрі. Генетичні та молекулярні інструменти, розроблені в цьому дослідженні, дозволять подальшу функціональну характеристику збереженого білка CNDP2 з використанням D. melanogaster як модельної системи.

Електронний додатковий матеріал

Інтернет-версія цієї статті (10.1186/s12863-019-0726-z) містить додаткові матеріали, доступні для авторизованих користувачів.

Передумови

Пептидази з різними субстратними особливостями відіграють неоднакову роль у метаболізмі білка та пептидів у еукаріотів. CNDP2 ссавців (також відомий як карнозиндипептидаза II, CN2, карбоксипептидаза глутамат-подібного, CPGL) належить до сімейства металопептидаз М20 і має широку субстратну специфічність для дипептидів [1, 2]. Він активний лише як гомодимер [3], а каталітичний домен кожної димерної субодиниці має один активний центр із двома іонами Mn 2+ або Zn 2+, які визначають специфічність ферменту для його фізіологічних субстратів [4]. На сьогодні CNDP2 є єдиною відомою протеазою, яка може каталізувати утворення псевдодипептидів молочної кислоти та амінокислот (N-лактоїл-амінокислот) шляхом зворотного протеолізу in vivo [5]. Таким чином, крім своєї протеолітичної активності, CNDP2 може виконувати інші клітинні функції.

Похибка експресія CNDP2 пов'язана з пухлинним генезом у людей. Знижений рівень CNDP2 спостерігався при раку підшлункової залози, гепатоцелюлярній карциномі та раку шлунка [2, 6, 7]. Ізоформа CNDP2, CPGL-B, у якій відсутня частина каталітичного домену, також брала участь у супресії пухлини, але наразі невідомо, чи має CPGL-B пептидазну активність [2, 6, 7]. Однак не всі пухлини характеризуються низьким рівнем CNDP2. Попередньо регульована експресія CNDP2 справді спостерігалася при раку молочної залози та раку нирок та товстої кишки [8–11]. Кілька досліджень були присвячені розумінню внеску CNDP2 у канцерогенез [2, 6–11], але модель тварин з мутованим CNDP2 наразі недоступна.

Білок CNDP2 є висококонсервативним серед видів [1, 12–14] і повсюдно експресується ([1]; База даних про гени та геноми дрозофіли, доступна на flybase.org [15]). У клітинах миші та людини CNDP2 локалізується в цитозолі та нуклеоплазмі (Атлас людського білка доступний на www.proteinatlas.org [16]); у тимчасово трансфікованих клітинах яєчників китайського хом'ячка (СНО) у цитоплазматичній фракції виявлено CNDP2 [1]. У D. melanogaster є лише один ген CNDP2 (CG17337; flybase.org [15]), надалі іменований dCNDP2. Вирівнювання амінокислотних послідовностей найдовшої ізоформи людського CNDP2 (475 амінокислот; номер приєднання GenPept> NP_060705.2) та найдовшої ізоформи Drosophila dCNDP2 (478 амінокислот; приєднання GenPept> NP_610181.2) виявлено 63 % ідентичності послідовності по всій довжині поліпептиду. Серед небагатьох генів D. melanogaster, що кодують білки металопептидази М20, повсюдно експресується лише dCNDP2 з помірним та високим рівнем (flybase.org [15]). Показано, що продукт цього гена є позаклітинним компонентом личинкової гемолімфи [17, 18], але його субклітинна локалізація невідома.

Для вирішення ролі CNDP2 у рості та проліферації клітин ми вирішили використати D. melanogaster як модельну систему. Легкість проведення геномних маніпуляцій у мух дозволяє досліджувати процеси як на організмі, так і на клітинах. У цьому дослідженні ми створили нульовий мутант dCNDP2, трансгенні лінії для індуцибельної експресії dCNDP2, поліклональні антитіла проти dCNDP2 і використовуємо ці інструменти для початкової характеристики білка.

Методи

Літати запаси

Мух вирощували та схрещували при 25 ° C за стандартними процедурами. Були використані наступні рядки Блумінгтонського фонду запасів дрозофіли (Блумінгтон, ІН; bdsc.indiana.edu): # 1824 (y 1 w *; P + mW.hs = GawB> AB1); # 32186 (w *; P + t7,7 w + mC = 10xUAS-IVS-mCD8: GFP> attP40); # 4775 (w 1118; P + mC = UAS-GFP.nls> 14); # 24488 (y 1 MZH-2A w *; MZH-102D); # 51325 (w 1118; PBac + mDint2 = vas-Cas9, U6-tracrRNA> VK00027) та # 6599 (y 1 w 67c23) як контролер дикого типу. Запас, що містить трансген нано-Крі [19] та лінію PattP154 [20], люб'язно надали Степан Н. Белякін та Сергій А. Демаков, відповідно (ІМЦБ СО РАН, Новосибірськ, Росія).

Плазмідні конструкції

Двадцятинуклеотидні спрямовуючі послідовності РНК (gRNA) для гена dCNDP2, gRNA1 (5′-GUAAAUAGAUUCGACGUAA-3 ′) і gRNA2 (5′-GAACCAGAUAUGACCCGCGA-3 ′), були розроблені за допомогою інструменту CRISPR/ Design (zlab.bio). дизайн-ресурси). Їх відповідні послідовності ДНК клонували у pU6-BbsI-chiRNA плазмідний вектор [21] нижче за промотором Drosophila U6, використовуючи сайти рестрикції BbsI для отримання pU6-5′dCNDP2-chiRNA та pU6-3′dCNDP2-chiRNA конструкцій. Кожна плазміда експресує химерну РНК (chiRNA), що складається з tracrRNA з Streptococcus pyogenes, із специфічною послідовністю 20-nt гРНК на 5 ′ кінці [21]. Плазмідний вектор pU6-BbsI-chiRNA був подарунком від Меліси Гаррісон та Кейт О’Коннор-Джайлз та Джилл Уайлдонгер (плазміда Addgene # 45946).

Плазмідна конструкція pGX-5 ′ & 3′-dCNDP2-нуль, що містить репортерську касету “GMR-підсилювач-міні-білий ген”, розміщену між двома фрагментами ДНК, які фланкують ген dCNDP2 у геномі D. melanogaster і тут іменуються 5 ′ - і 3'-гомологічні плечі (або просто лівий і правий плечі), виготовляли наступним чином. Спочатку ліву руку (2R: 5,695,002–5,696,806; тут і потім координати випуску 6 збірки геному D. melanogaster [22]) клонували у вектор плазміди pGX-attP [23], використовуючи унікальні NotI та KpnI сайтів. Отримано проміжну плазміду pGX-5′-dCNDP2-нуль. Далі праву руку (2R: 5 701 122–5 703 566) клонували у нуль-плазміду pGX-5′-dCNDP2 за допомогою унікальних сайтів AscI та XhoI для отримання нульової конструкції pGX-5 ′ & 3′-dCNDP2-нуль. Клонована права рука містить наступні три одиничні нуклеотидні варіації, всі перед початком місця транскрипції гена vlc: 5 701 650 T> C, 5 701 704_5 701 705insA та 5 701 862 T> C. Було надано плазмідний вектор pGX-attP [23] Сергій Олександрович Демаков (ІМЦБ СО РАН, Новосибірськ, Росія).

Щоб створити рятувальну конструкцію pGE-attB-GMR-dCNDP2, ми клонували фрагмент геномної ДНК на 4,3 кб, що несе ген dCNDP2 (2R: 5,696,807–5,701,121), у плазмідний вектор pGE-attB-GMR [23], використовуючи унікальний NheI та Сайти AscI. Клонований фрагмент ДНК містить наступні вісім одиночних нуклеотидних варіацій всередині і поблизу гена dCNDP2: 5697584C> T (перед початком дистальної ділянки транскрипції), 5698421 T> A, 5699251 T> G, 5699713G> T, 5699725del ( в інтронічних регіонах), 5 699 463 G> A (синонімічна заміна), 5700 144 T> A (в 3 'неперекладеній області) і 5700 278 T> C (нижче за течією сайту припинення транскрипції). Плазмідний вектор pGE-attB-GMR [23] люб'язно надав Сергій Олександрович Демаков (ІМЦБ СО РАН, Новосибірськ, Росія).

Щоб сформувати конструкцію pUASTattB-dCNDP2 для ектопічної експресії білка dCNDP2, ми спочатку ампліфікували ПЛР послідовністю ДНК (що відповідає нуклеотидам 100–1536 з номера приєднання GenBank> NM_136337.3, але з нуклеотидом 1023G> A і 1154A> T). заміни), що кодують довшу ізоформу dCNDP2 (478 амінокислот; далі dCNDP2-A). Як шаблон ми використовували кДНК, синтезовану із загальної РНК, виділеної від 0 до 24 годин ембріонів із штаму Canton-S дикого типу. Потім ампліфікований фрагмент ДНК клонували у плазмідний вектор pUASTattB [24] за допомогою унікальних сайтів EcoRI та XbaI.

Для створення конструкцій pUASTattB-eGFP-dCNDP2 та pUASTattB-dCNDP2-eGFP для ектопічної експресії злитих білків dCNDP2, позначених N- та C-кінцевими eGFP, ми використовували послідовність кодування dCNDP2-A у повній довжині (див. Вище). Він був злитий у кадрі або нижче, або за течією кодуючої послідовності eGFP, використовуючи спрямований на сайт мутагенез шляхом розширення перекриття [25]. Потім фрагменти ДНК клонували у плазмідний вектор pUASTattB [24] з використанням унікальних сайтів EcoRI та XbaI та EcoRI та KpnI відповідно.

Для отримання конструкції pGEX-4 T-dCNDP2 кодовану послідовність кодування dCNDP2-A на повну довжину (див. Вище) клонували у кадрі у плазмідний вектор pGEX-4 T-1 (GE Healthcare) нижче за глутатіон S-трансферазою (GST) кодуюча послідовність з використанням сайтів BamHI та XhoI.

Всі плазмідні конструкції були перевірені шляхом секвенування ДНК. Деталі конструкцій плазмід надаються за запитом.

Редагування геному зародків та трансгенез

Щоб генерувати нульовий алель dCNDP2, цільові конструкції pU6-5′dCNDP2-chiRNA та pU6-3′dCNDP2-chiRNA та донорну конструкцію pGX-5 ′ & 3′-dCNDP2-null, всі розчинені у воді, змішували до остаточного концентрації 125 нг/мкл, 125 нг/мкл та 500 нг/мкл відповідно. Суміш вводили в ембріони w 1118; PBac + mDint2 = vas-Cas9, U6-tracrRNA> штам VK00027 (запас Bloomington # 51325) згідно зі стандартною процедурою, як описано раніше [26]. Загалом було введено 986 ембріонів, з яких лише 191 (19,4%) розвинувся до дорослої стадії. Трансформантів ідентифікували у потомстві G1 фертильних ін’єкцій за фенотипом w +. Ми виявили лише одного такого самця мухи, що вказує на те, що ефективність опосередкованого CRISPR/Cas9 HR у локусі dCNDP2 становила 0,1% (1/986). Плазміду pGE-attB-GMR-dCNDP2 вводили з концентрацією 300 нг/мкл в ембріони ∆dCNDP2, експресуючи інтегразу phiC31 у зародковій лінії [24]. Плазміди pUASTattB-dCNDP2, pUASTattB-eGFP-dCNDP2 і pUASTattB-dCNDP2-eGFP вводили індивідуально в концентрації 300 нг/мкл в ембріони, що несли місце посадки attP154 [20], і виражали інтегразу phiC31 в зародковій лінії [24].

Екстракція геномної ДНК та генотипування ПЛР інженерних алелів dCNDP2

Для виділення геномної ДНК 3–5 мух подрібнювали в 200 мкл буфера для екстракції ДНК (100 мМ Трис-HCl [рН 7,5], 100 мМ NaCl, 0,5% SDS, 50 мМ ЕДТА [рН 8,0], 200 мМ сахарози) в 1,5-мл пробірку, а зразок інкубували при 65 ° С протягом 30 хв. Далі додавали 300 мкл 5 М KAc, добре перемішували інверсією і зразок витримували на льоду протягом 30 хв. Пробірку центрифугували протягом 15 хв при 14000 об/хв. Потім супернатант переносили в нову пробірку і ДНК осаджували етанолом. Нарешті, гранулу розчинили у 10–50 мкл безнуклеазної води. ПЛР проводили за допомогою ДНК-полімерази Hot-Start Taq (Biolabmix, MH010) відповідно до рекомендацій виробника. Для генотипування локусу dCNDP2 після кожного етапу його модифікації використовували специфічні для алеля пари праймерів (Додатковий файл 1: Таблиця S1). Продукти ПЛР аналізували на 1% агарозному гелі разом із ДНК-сходами GeneRuler 1 Kb Plus (Thermo Scientific, SM1331).

Виробництво антитіл проти dCNDP2

Злитий білок GST-dCNDP2 експресували у штамі Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (Promega) і згодом очищали, як описано раніше [27]. Очищений злитий білок GST-dCNDP2 використовували для імунізації мишей. Як повідомлялося раніше, поліклональні антитіла очищали за спорідненістю із сироватки [27].

Культура клітин S2 та інтерференція РНК (RNAi)

Спочатку ми обрали фрагмент гена dCNDP2 826 bp, який присутній в обох ізоформах транскрипту гена, як шаблон для синтезу дволанцюжкової РНК (dsRNA). Ми ампліфікували фрагмент ДНК за допомогою праймерів 5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGGcgagatcggtcg-3 ′ та 5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGGatagcgccacctgg-3 ′, які містять послідовність промотора полімерази T7 на їх 5 ′ кінцях (показано великими літерами). Продукт ПЛР очищали за допомогою набору для очищення ПЛР GeneJET (Thermo Scientific, K0702), а потім використовували як шаблон для синтезу дсРНК, як описано раніше [28], з незначними модифікаціями. Обробку DNaseI проводили після нагрівання синтезованої dsRNA до 65 ° C та повільного її охолодження до кімнатної температури; крім того, екстракція фенол/хлороформ була опущена.

Клітини S2 були вільні від забруднення мікоплазмою і культивувались у 39,4 г/л щитів та середовищі Sang M3 Insect (Sigma, S8398) з додаванням 0,5 г/л KHCO3 та 20% теплової інактивованої фетальної бичачої сироватки (FBS; Thermo Scientific, 10270106) при 25 ° C. Лікування RNAi проводили, як описано раніше [29], з наступними модифікаціями. Двадцять п’ять мкг очищеної дсРНК додавали до клітин три рази (на перший, третій та п’ятий дні інкубації), і клітини збирали для аналізів через 7 днів RNAi. Контрольні зразки клітин S2 готували таким же чином, але без додавання dsRNA.

Вестерн-блот

Імунофлуоресцентне (ІФ) фарбування

Імуноофарбовування клітин S2 та здушені політенові хромосоми слинних залоз проводили, як описано раніше [31, 32]. Первинні мишачі поліклональні антитіла α-dCNDP2 використовували у розведенні 1: 1000 і виявляли антитілами IgG козячих α-мишей, кон’югованими з Alexa Fluor 488 (1: 500; Invitrogen, A-11001). Якщо зображення клітин S2 були зроблені з використанням конфокального мікроскопа Zeiss LSM 710 та масляної апо-лінзи площею 100 ×/1,40. Якщо зображення політенових хромосом були отримані за допомогою флуоресцентного мікроскопа Zeiss Axio Observer.Z1, оснащеного монокамерою Axiocam 506 mono (D), що використовує масляну лінзу 63 ×/1,40. В обох випадках для отримання зображень використовувалося програмне забезпечення ZEN 2012.

Для виявлення злитих білків dCNDP2, мічених eGFP, цілі слинні залози фіксували в PBS, що містить 4% формальдегіду (Merck, 104003), промивали 3 рази протягом 5 хв кожною PBS, що містить 0,5% Triton X-100, фарбували протягом 30 хв 0,4 мкг/мл DAPI, розчиненого в PBS і змоченого в 50% гліцерині, розчиненому в PBS. Якщо зображення цільномонтованих залоз отримували на конфокальному мікроскопі Zeiss LSM 710 із використанням лінзи 20 ×/0,50 EC Plan-Neofluar. Оптичні секції поєднували за допомогою програмного забезпечення LSM Image Browser версії 3.5 (Zeiss).

Результати

Для вирішення функції dCNDP2 ми генерували нульову мутацію гена ∆dCNDP2, використовуючи нещодавно розроблений метод HR-опосередкованого CRISPR/Cas9 [21], що детально проілюстровано на рис. 1 та в додатковому файлі 2: Рис. S1. Кінцевим продуктом цієї процедури стала нульова мутація ∆dCNDP2, яка несе сайт phiC31 attP замість

Послідовність ДНК 4,3 kb, що містить весь ген dCNDP2. Ми виявили, що гомозиготні мутанти не виявляють видимих морфологічних відхилень і є родючими. Ми також використовували рекомбінацію, опосередковану інтегразою phiC31, для отримання того самого

Фрагмент ДНК розміром 4,3 кб, який був видалений у ∆dCNDP2 назад у своє початкове геномне розташування та створив алель ∆dCNDP2 (порятунок) (рис. (Рис. 1; 1; додатковий файл 2: рисунок S1).