Межі у фармакології

Інтегративна та регенеративна фармакологія

Редаговано

Пол Р. Ернсбергер

Школа медицини, Університет Кейс Вестерн Резерв, США

Переглянуто

Медардо Ернандес

Університет Комплутенсе в Мадриді, Іспанія

Хун Чжань

Інститут досліджень Морґріджа, США

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

Завантажити статтю
- Завантажте PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Додаткові
  Матеріал
Експортне посилання
- EndNote
- Довідковий менеджер
- Простий текстовий файл
- BibTex

ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

1 Кафедра біологічної та медичної фізики Московського фізико-технічного інституту, Долгопрудний, Росія
2 Інститут біології Комі Науковий центр Уральського відділення РАН, Сиктивкар, Росія
3 Кафедра екології, Сиктивкарський державний університет, м. Сиктивкар, Росія
4 Інститут молекулярної біології Енгельгардта РАН, Москва, Росія
5 Insilico Medicine, Inc., Університет Джона Хопкінса, Балтимор, США, США

Вступ

Експерименти, проведені на різних модельних організмах, показали, що можна фармакологічно модифікувати активність пов'язаних з довголіттям сигнальних шляхів. Флавоноїди - це група природних біологічно активних сполук (Zern and Fernandez, 2005; Vauzour et al., 2008; Kumar and Pandey, 2013; Brodowska, 2017). Геропротекторний вплив різних флавоноїдів на модельні організми вивчався в численних дослідженнях, більшість з яких використовують Caenorhabditis elegans як модельний організм для дослідження впливу флаванолів, флавонолів та рослинних екстрактів (Pallauf et al., 2017). Однак цей напрям досліджень не був без суперечок. Експерименти, що стосуються використання однієї сполуки, дали суперечливі або суперечливі результати при проведенні на кількох модельних організмах. Наприклад, було встановлено, що кверцетин збільшує тривалість життя Saccharomyces cerevisiae (Belinha et al., 2007) та C. elegans (Kampkotter et al., 2008; Saul et al., 2008; Pietsch et al., 2009), але не мали впливу на мишей (Jones and Hughes, 1982; Spindler et al., 2013). Ці дослідження підкреслюють важливість відтворюваності геропротекторних ефектів сполуки серед різних модельних організмів, особливо з огляду на те, що пов'язані з довголіттям сигнальні шляхи дуже еволюційно консервативні (Moskalev et al., 2016). Наприклад, збільшення тривалості життя багатьох організмів спостерігалося для протизапального препарату ібупрофену (He et al., 2014) та імунодепресанта рапаміцину (Harrison et al., 2009; Bjedov et al., 2010; Robida-Stubbs et al. ., 2012).

Матеріали і методи

C. elegans Аналіз тривалості життя

C. elegans Аналіз стресостійкості

Експерименти з оцінки стресостійкості проводили на 5-й день лікування флавоноїдами. В експериментах щодо окисного стресу до нематод додавали 100 мМ параквату (метилвіолог, Acros Organics). В експериментах, що випробовували тепловий удар, черв'яків нагрівали до 33 ° С. Кількість загиблих глистів підраховували через 24 год. Для кожного типу стресу експеримент проводили у трьох примірниках. Для кожної експериментальної групи в кожному експерименті було використано 35–117 нематод, загальна кількість у всіх проведених експериментах становила не менше 170 для кожного варіанту. Дані трьох експериментів поєднували. Статистичне порівняння відсотка загиблих тварин для комбінованих даних було проведено за допомогою test-тесту Фішера (Fisher, 1954).

D. melanogaster Аналіз тривалості життя

Дикий тип Canton-S D. melanogaster (Bloomington Stock Center, США) були розділені за статтю і розміщені у флаконах розміром 25 мм × 95 мм (30 мух на флакон) із цукрово-дріжджовим середовищем наступного складу на 1 л: сухі дріжджі - 8 г, агар - 7 г, цукор - 30 г, манна каша - 30 г, пропіонова кислота - 8 крапель (Ashburner, 1989). Для кожної експериментальної групи використовували 100–150 мух. Мух тримали при 25 ° C з 12-годинним циклом світло/темрява. Вихідні розчини ДМСО досліджуваних сполук розчиняли у дріжджовій пасті з кінцевими концентраціями або 0,3, 0,5 та 1 мкМ. Ці концентрації були обрані, оскільки вони вважаються фізіологічними (Kanazawa, 2011). Цю суміш наносили на поверхню живильного середовища, починаючи з першого дня дорослості. Мух перекладали у нові пляшки двічі на тиждень. Кількість загиблих мух підраховували не менше трьох разів на тиждень. Експеримент повторювали тричі. Проводили ті ж статистичні аналізи, що і для глистів.

D. melanogaster Аналіз стресостійкості

Експерименти зі стресостійкості проводили на 10-й день лікування флавоноїдами. Для кожної експериментальної групи використовували 100–150 мух. В експериментах з випробування окисного стресу мух переміщували у флакони з фільтрувальним папером, змоченим у 20 мМ розчині параквату (метилвіологен, Sigma) у 5% сахарозі (0,2 мл на флакон) через 2 години голодування. Мух голодували, перекладаючи у флакони з фільтрувальним папером, насиченим водою замість живильного середовища. В експериментах з приводу стресового стресового стану флакони, що містять мух і живильне середовище, були нагріті до 35 ° C. Кількість загиблих мух підраховували двічі на день. Для кожного типу стресу експеримент проводили у трьох примірниках. Дані трьох експериментів поєднували. Значимість відмінностей між групами для комбінованих даних оцінювали за допомогою test-критерію Фішера (Fisher, 1954).

D. melanogaster Аналіз плодючості

Плодючість самок оцінювали один раз на тиждень, поміщаючи трьох самок та трьох чоловіків того ж віку у флакони зі свіжими поживними речовинами, пофарбованими активованим вугіллям, і даючи 24 години для відкладання яєць. Через 24 години підраховували кількість яєць на самку. Для кожного експериментального варіанту було використано 50 плідних самок. Самців замінювали молодими мухами раз на місяць. Статистичну значимість між кумулятивними кривими оцінювали за допомогою тесту χ 2, використовуючи програму Statistica 6.1 (StatSoft, США) (Fisher, 1954).

D. melanogaster Аналіз спонтанної активності

Для кожного експериментального варіанту було відібрано 30 мух (10 мух на флакон). Чоловіків і жінок аналізували окремо. Мух утримували в стандартних умовах і переносили на нові середовища двічі на тиждень. Стихійну активність тестували протягом 24 годин щотижня за допомогою апаратно-програмного комплексу “Drosophila Population Monitor” (TriKinetics, Inc., США). Статистичний аналіз проводили за допомогою тесту χ 2 із використанням програми Statistica 6.1 (StatSoft, США) (Fisher, 1954).

RT-PCR

У цьому тесті вивчали лише 0,3 та 1,0 мкМ концентрацій вибраних сполук. На 10-й день споживання флавоноїдів мух гомогенізували. РНК екстрагували за допомогою реагенту для лізису QIAzol (Qiagen, Нідерланди) з подальшим осадженням ізопропанолу. РНК очищали за допомогою DNase I, Amplification Grade kit (Life Technologies, Бреда, Нідерланди) відповідно до протоколу виробника. Синтез кДНК проводили за допомогою зворотної транскриптази Revert Aid, як рекомендував Fermentas. ПЛР у реальному часі проводили на ПЛР-системі 7500 в реальному часі (Applied Biosystems, США), використовуючи таку процедуру: (1) денатурація протягом 10 хв при 95 ° C, (2) денатурація протягом 15 с при 95 ° C, (3) відпал протягом 30 с при 60 ° C, (4) подовження протягом 30 с при 60 ° C. Етапи 2–4 повторювали 50 разів.

EF1α та β-Тубулін використовувались для нормалізації експресії, оскільки вони були найбільш стабільними серед чотирьох випробуваних генів (Актин, RpL32, EF1α, β-Тубулін). Відносну експресію досліджуваних генів розраховували, як було описано раніше (Жикревецька та ін., 2015). Послідовності праймерів для досліджуваних генів представлені в додатковій таблиці 1.

Відмінності між відносними значеннями виразу вважалися значущими лише у тому випадку, якщо вони були статистично значущими відповідно до Стьюдента т-тесту і враховували принаймні двократну зміну експресії досліджуваного гена через біологічні варіації рівнів експресії референтних генів (Log2FC> 1).

Кількісна оцінка експресії гена репортера GFP

У цьому експерименті D. melanogaster трансгенна лінія с GstD1-GFP репортер був використаний. Лінію люб’язно надав доктор Тауер (Університет Південної Каліфорнії, Лос-Анджелес, Каліфорнія, США).

Для вимірювання GstD1-GFP репортерська експресія, мухи знеболювали та фотографували за допомогою флуоресцентного мікроскопа “MICMED-2 var.11” (LOMO, Росія) та відеосистем на базі цифрової камери Olympus C7070 (Olympus, Японія) на 10-й та 30-й дні споживання флавоноїдів. Виправлену загальну флуоресценцію клітин (CTCF) розраховували за допомогою програмного забезпечення ImageJ (Національний інститут охорони здоров’я, США), як описано в інших місцях (Cali et al., 2015). Той самий аналіз проводили на мухах, оброблених протягом 12 год 20 мМ параквату (метилвіолог, Sigma) у 5% сахарозі (0,2 мл на флакон). Для кожної експериментальної групи було використано 10 мух.

Аналіз схожості на рівні шляху

Аналіз шляхів передачі сигналів є загальним підходом для отримання розуміння з великомасштабних транскриптомних та протеомічних даних. Для отримання балів активації сигнального шляху (PAS) ми використали in silico Аналіз декомпозиції мережі активації шляху (iPANDA), який ми застосували до великомасштабних транскриптомних наборів даних як метод розвитку біомаркерів (Озеров та ін., 2016). На відміну від інших методів, iPANDA генерує PAS, використовуючи дані попередньо обчислених генних коекспресійних генів у поєднанні з факторами важливості генів, кількісно визначеними залежно від ступеня диференціальної експресії гена та декомпозиції топології шляху.

Для отримання сигнальних PAS ми використовували дані відповіді транскрипції, надані проектом LINCS Project 1. Ми вибрали зразки експресії генів лікарської реакції транскрипції з клітинних ліній A549 та MCF7. Колекція сигнальних шляхів отримана з колекції SABiosciences 2, в якій є 378 сигнальних шляхів. Всього було розглянуто 15 489 сполук. Подібність між двома сполуками вимірювали як відсоток часто регульованих вгору або вниз шляхів. Аналіз схожості на рівні шляху був проведений лише для нарингіну, оскільки немає даних про відповідь транскрипції для хризину та лютеоліну.

Результати

Вплив вивчених флавоноїдів на C. elegans Тривалість життя

Вивчені флавоноїди мали позитивний вплив на середній термін життя нематод у певних концентраціях (Додаткова таблиця 2). Найбільш виражені ефекти нарингіну спостерігалися при концентраціях 5 мкМ (рис. 1А). Додавання нарингіну в цій концентрації збільшило середню тривалість життя глистів на 7,7–15,4% (стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор 2 тест.

Вплив тестованих флавоноїдів на спонтанну активність був не таким однозначним. Хоча статистичний аналіз виявив зміни порівняно з контрольними мухами, можна зробити висновок, що наслідки були переважно нейтральними. Хоча ці флавоноїди збільшували спонтанну активність як чоловіків, так і жінок протягом певних інтервалів часу, вони, як видається, мали шкідливі наслідки протягом інших періодів часу (Рисунок 8).

РИСУНОК 8. Спонтанна рухова активність Drosophila melanogaster чоловіки (♂♂) і жінки (♀♀), які отримували нарингін (A), лютеолін (B), і хризин (C); ∗ стор 2 тест.

Вплив вивчених флавоноїдів на експресію генів стресової реакції мух

Досліджено вплив досліджуваних флавоноїдів на експресію генів стресової відповіді. Серед 15 досліджених генів лише зміни в Hsp70 ген можна вважати значущим (рис. 9). У самок, Hsp70 рівні експресії зменшились у 2,1–5,7 рази (стор ∗ стор 2 тест.

Вплив вивчених флавоноїдів на сигнальний шлях Keap1/Nrf2 у мух

РИСУНОК 10. Відносна флуоресценція GstD1-GFP репортер у Drosophila melanogaster чоловіки після лікування нарингіном (A), лютеолін (B), і хризин (C); ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор 2 тест.

РИСУНОК 11. Відносна флуоресценція GstD1-GFP репортер у Drosophila melanogaster самки після лікування нарингіном (A), лютеолін (B), і хризин (C); ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор 2 тест.

Подібність на рівні шляху

Для визначення подібності на рівні шляху було застосовано алгоритм iPANDA. Для кожної сполуки були розраховані PAS збурення для 378 шляхів. Схожість між ознаками активації шляху природних сполук та рапаміцину оцінювали за кількістю часто регульованих вгору та вниз шляхів між 15 489 сполуками. Результати аналізу на рівні шляху представлені в додаткових таблицях 7, 8.

Найкраща подібність (рейтинг 348 із 15 489) спостерігалася між нарингіном (час впливу 24 год, концентрація 10 мкМ) та рапаміцином (час впливу 24 год, концентрація 0,4 мкМ) у клітинній лінії A549, але в цьому випадку кількість загальнорегульованих шляхів було лише 88 із 378 проаналізованих. Найвища кількість загальнорегульованих шляхів між нарингіном та рапаміцином становила 229 і спостерігалась у клітинах MCF7. Однак у порівнянні з іншими сполуками ранг нарінгіну досить низький (ранг 1306 з 15 489). Таким чином, можна зробити висновок, що нарінгін та рапаміцин мають досить різні механізми дії, принаймні в клітинах A549 та MCF7.

Обговорення

У певних концентраціях досліджувані сполуки покращували параметри тривалості життя C. elegans модельний організм. Лютеолін та хризин також покращили параметри тривалості життя D. melanogaster самки без зниження залежних від старіння фізіологічних параметрів (плодючість та рухова активність), але не впливали на чоловіків. Нарінгін не впливав на тривалість життя самок і при найвищій концентрації (1 мкМ) зменшував параметри тривалості життя самців. Крім того, флавоноїди або не мали ефекту, або у високих концентраціях знижували стійкість до стресів нематод і мух.

Для жінок усі досліджувані сполуки були пов'язані зі зниженням Hsp70 експресія гена. Для чоловіків лише нарінгін асоціювався зі зниженням Hsp70 експресія гена. Нижче регулювання Hsp70 ген є відомим ефектом таких флавоноїдів, як кверцетин (Tatsuta et al., 2014), фізетин (Kim et al., 2015) та епігалокатехін-3-галлат (Tran et al., 2010). Білки Hsp70 захищають клітини від різного роду стресу, беручи участь у протеостазі та відіграючи роль у клітинних процесах, таких як апоптоз або проліферація через взаємодію з регуляторними білками (Mayer and Bukau, 2005; Gong and Golic, 2006). Hsp70 надмірна експресія пов’язана зі збільшенням тривалості життя у мух (Tatar et al., 1997). З іншого боку, було помічено, що мухи з вищим рівнем Hsp70-GFP репортер вмирає швидше, ніж мухи нижчого рівня (Ян та Тауер, 2009). Таким чином, низький рівень Hsp70 може бути біомаркером молодшого біологічного віку.

Лютеолін і хризин мають на В-кільці дві та нульові гідроксильні групи. Згідно з літературою, здатність флавонолів, іншого підкласу флавоноїдів, збільшувати тривалість життя модельних організмів залежить від кількості гідроксильних груп на їх B-кільці, причому більше гідроксильних груп асоціюється з більш вираженими ефектами (Grunz et al., 2012). У наших експериментах ми не спостерігали різких відмінностей між ефектом лютеоліну та хризину на параметри тривалості життя C. elegans і D. melanogaster. Однак додавання лютеоліну призводило до більш вираженого зменшення Hsp70 Рівні мРНК через 10 днів лікування. Крім того, на відміну від хризину, лютеолін також знижував рівень GstD1-GFP репортерний ген у деяких випадках. Таким чином, лютеолін є більш біологічно активним, ніж хризин.

Результати наших експериментів демонструють здатність флавонів хризину та лютеоліну покращувати тривалість життя обох C. elegans і D. melanogaster біологічні моделі. Можливий механізм їх дії полягає в активації AMPK. Навіть незважаючи на те, що нарінгін не продемонстрував позитивного впливу на тривалість життя D. melanogaster, це дало найбільш виражені ефекти на активацію цілі Nrf2. Аналіз даних транскрипційної відповіді клітинних ліній A549 та MCF7 (результат проекту LINCS) показав, що рапаміцин та нарінгін активують та інгібують деякі загальні сигнальні шляхи. Однак здебільшого механізми їх дії різні.

Внески автора

EL, EP, MV, AZ та AM написали рукописний текст. EL, NZ, EP, AK, MV, EM та SL провели експерименти та обробили статистичний аналіз. А.М. керував дослідженнями та текстом рукопису. Усі автори прочитали та схвалили остаточний рукопис.

Фінансування

Ця робота була підтримана Російським науковим фондом (грант/номер премії: 14-50-00060).

Заява про конфлікт інтересів

Автори заявляють, що дослідження проводилось за відсутності будь-яких комерційних або фінансових відносин, які можна трактувати як потенційний конфлікт інтересів.