Короткочасне обмеження калорій покращує відновлення ДНК за рахунок негомологічних кінцевих з’єднань у мишей

Предмети

Анотація

Обмеження калорій (CR) покращує стан здоров'я, зменшує рівень захворюваності на рак та продовжує тривалість життя у багатьох організмів, включаючи мишей. Показано, що CR покращує відновлення базової ексцизії та шляхи відновлення нуклеотидів виправлення ДНК, однак, чи покращує CR репарацію дволанцюжкових розривів ДНК, не досліджували в системі in vivo. Тут ми використовуємо не-гомологічних мишей-репортерів, що приєднують кінці (NHEJ), щоб показати, що короткочасний CR сильно посилює відновлення ДНК NHEJ, що пов'язано з підвищеним рівнем DNA-PK і SIRT6.

Ми створили мишку-репортера, яка дозволяє кількісно вимірювати ефективність NHEJ in vivo, використовуючи ендонуклеазу I-SceI, щоб індукувати розриви дволанцюжкової ДНК в межах касети-репортера NHEJ, інтегрованої в локус ROSA26 19 (рис. 1а). Касета-репортер NHEJ 19 складається з гена GFP, перерваного щурячим інтроном Pem1, який не має гомології з геномом миші, та "вбивчого" екзону, оточеного сайтами I-SceI. GFP інактивується наявністю екзона-вбивці в невпорядкованій конструкції. Скорочення I-SceI призводить до вивільнення екзона-вбивці, тоді як успішна репарація NHEJ релігує інтрон, що призводить до реактивації гена GFP. Події відновлення NHEJ, що відбуваються в межах інтрону, переносять видалення (до 1 кб на кожну сторону розрізу) та вставки без втручання в діяльність GFP.

Модель репортерської миші NHEJ пропонує новий інструмент для вивчення впливу CR на ефективність NHEJ in vivo. У попередніх звітах не вивчався вплив короткострокової CR на NHEJ. Слід зазначити, що повідомляється, що 4 тижні CR достатньо для пом’якшення вікових змін в метиломі ДНК 20, припускаючи, що короткочасного CR може бути достатньо для підвищення ефективності відновлення ДНК. У цьому звіті ми використовували мишей-репортерів NHEJ для вивчення впливу короткочасних 40% CR на ефективність NHEJ. Ми виявили, що ефективність NHEJ значно покращилася завдяки короткочасному CR.

Щоб розрахувати добове споживання калорій у мишей-репортерів NHEJ, ми годували мишей ad libitum без пилової точної дієти з гранулами та підраховували кількість споживаних гранул. Миші споживали в середньому 14,3 ± 1,3 ккал на добу під час годування ad libitum і підтримували свою масу тіла (рис. 1б). У групі CR мишей годували 8,4 ккал/день, що дорівнювало 60% середньодобового споживання калорій. Миші CR втрачали масу тіла протягом перших двох тижнів годування, а потім зберігали свою масу тіла (рис. 1в). Усі миші були одинарними, щоб забезпечити рівне споживання їжі. Мишей забивали через 4 тижні від початку дієти. NHEJ вимірювали в первинних клітинах, виділених зі свіжої шкіри, легенів, нирок та мозку мишей. Аналіз NHEJ проводили, як описано раніше 19. Коротко кажучи, клітини ко-трансфікували плазмідою, що кодує фермент I-SceI, для індукції DSB і плазмідою DsRed для нормалізації ефективності трансфекції та аналізували за допомогою проточної цитометрії. Ефективність NHEJ розраховували як відношення GFP + до клітин DsRed +. I-SceI, NHEJ-GFP та DsRed експресуються з промотору CMV. Важливо, що CR не змінював інтенсивності флуоресценції DsRed (додаткова фіг. 1c), припускаючи, що CR не впливає на експресію I-SceI.

Ми виявили, що короткочасний CR значно підвищує ефективність NHEJ у шкірі, легенях, нирках та тканинах мозку порівняно з мишами, що харчуються ad libitum у шкірі, легенях, нирках та мозку (рис. 1г). Це збільшення було пов’язане з підвищеним рівнем ДНК PK (рис. 1e, f) та SIRT6 (рис. 1e, g). Ці результати вказують на те, що короткострокової CR є достатньою для посилення NHEJ.

Дуже великі делеції можуть поширюватися в область кодування GFP і призвести до втрати сигналу. Хоча теоретично лікування CR може змінити вірність відновлення, з попередніх досліджень секвенування на тваринах AL того самого штаму делеції дуже рідко поширюються на область кодування гена GFP 19. Отже, спостережувані зміни ефективності NHEJ не можна пояснити зміною вірності NHEJ.

Попередні дослідження показали, що CR запобігає віковому зниженню здатності до відновлення 17,18, тоді як тут ми показуємо, що короткочасний CR посилює NHEJ у молодих тварин. Цей короткочасний КР, або, можливо, періодичне голодування може забезпечити додаткову користь. Екологічний стрес, наданий CR, може спричинити горметичну реакцію шляхом активації стресово-реакційних шляхів, таких як SIRT6, та механізмів регулювання ДНК, що регулюють. Поліпшення ефективності NHEJ призведе до зниження рівня стійкого пошкодження ДНК, зменшення загибелі клітин, поліпшення стабільності геному та зменшення мутаційного навантаження. Ця покращена стабільність геному, швидше за все, сприятиме зниженню захворюваності на рак та збільшенню тривалості життя, передбаченого CR. Наш висновок про те, що навіть короткочасного КР достатньо для спрацьовування цих сприятливих ефектів, важливий для практичного застосування ХР у людей, де довготривалого КР важко досягти, тоді як короткочасний КР або періодичне голодування є більш можливим.

Методи

Тварини

Всі експерименти на мишах проводились відповідно до рекомендацій, встановлених Комітетом тваринних ресурсів Рочестерського університету. У цьому дослідженні використовувались миші-самці, і всі вони були поодинокими для проведення експериментів з контролем калорій. Експерименти проводили на 3–5-місячних мишах C57BL/6, що містять касету-репортер NHEJ у локусі ROSA26, створеному Vaidya та співавт. 19 .

Адміністрування КР

Мишей годували дієтою Dustless Precision Pellet (BioServ, Cat # F0074). Розрахована кількість прецизійного гранульованого корму клали на підлогу клітини щоранку, залишки харчових гранул підраховували та виймали щодня перед тим, як було надано нове харчування. Одна миша загинула і була припинена з експериментів з CR та виключена для аналізу NHEJ.

Аналіз NHEJ

Первинні культури клітин були виділені із шкіри, легенів, нирок та мозку мишей, як описано раніше 19. Мільйон первинних культивованих клітин трансфікували 5 мкг плазміди pCMV-I-SceI для індукції ДНК DSB та 0,1 мкг плазміди pCMV-DsRed для нормалізації ефективності трансфекції, використовуючи програму T-020 Amaxa Nucleofector II. Клітини миші демонструють високий рівень автофлуоресценції, який необхідно виключити для отримання надійних даних. Щоб уникнути проблеми автофлуоресценції, ми використовували дуже малу кількість плазміди DsRed, таку, що вона не кооперується з сигналом GFP, що дозволяє виключити автофлюоресцентні клітини (додаткова фіг. 1b). Через три дні після трансфекції клітини збирали, а кількість клітин GFP + та DsRed + аналізували за допомогою проточної цитометрії. Для окремих первинних культур проводили триразові трансфекції, а ефективність NHEJ розраховували як відношення GFP + до клітин DsRed +.

Вестерн-блот

Експоненціально зростаючі клітини збирали за допомогою трипсину, підраховували і 10 6 клітин ресуспендували в 100 мкл PBS, що містить інгібітори протеази. Додавали 100 мкл 2-кратного буфера Леммлі (Bio-Rad) і зразки кип'ятили при 95 ° С протягом 10 хв. Зразки відокремлювали з градієнтом 4–20% SDS-PAGE, переносили на мембрану PVDF і блокували у 5% -ному TBST молока протягом 2 годин при кімнатній температурі. Потім мембрани інкубували протягом ночі при +4 ° C з моноклональними антитілами кролика проти ДНК PKcs (Abcam, ab32566, 1: 1000), моноклональними антитілами кролика анти-Sirt6 (CST, # 12486, 1: 1000) або кролячими поліклональними антитілами проти Гістон H3 (Abcam, ab1791, 1: 10000) у 5% BSA-TBST. Після трьох промивань протягом 10 хв TBST мембрани інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з козячим анти-кролячим IgG H&L (HRP) (Abcam, ab6721, 1: 5000). Після трьох промивань з використанням TBST був розроблений сигнал із підкладкою Clarity Western ECL (Bio-Rad). Кількість зображень визначали за допомогою Image Lab (Bio-Rad). Всі показані блоти були отримані в одному експерименті та оброблялись паралельно.

Резюме звітів

Подальша інформація про розробку досліджень доступна в Резюме звітів про дослідження природи, пов’язаному з цією статтею.

Наявність даних

Усі дані, створені або проаналізовані в ході цього дослідження, включені в цю опубліковану статтю (та додаткові інформаційні файли) або доступні авторам за обґрунтованим запитом.

Список літератури

Фонтана, Л., Партрідж, Л. та Лонго, В. Д. Подовження здорового періоду життя - від дріжджів до людини. Наука 328, 321–326 (2010).

Меттсон, М. П. Споживання енергії, частота прийому їжі та здоров'я: нейробіологічна перспектива. Анну. Преподобний Нутр. 25, 237–260 (2005).

Weindruch, R. & Walford, R. L. Дієтичні обмеження у мишей, починаючи з віку 1 року: вплив на тривалість життя та спонтанні випадки раку. Наука 215, 1415–1418 (1982).

Андерсон, Р. М., Шанмуганагамага, Д. і Вайндрух, Р. Калорійне обмеження та старіння: дослідження на мишах та мавпах. Токсикол. Патол. 37, 47–51 (2009).

Ю., Б. П. Старіння та окислювальний стрес: модуляція шляхом обмеження дієти. Вільний Радич. Біол. Мед. 21, 651–668 (1996).

Zainal, T. A., Oberley, T. D., Allison, D. B., Szweda, L. I. & Weindruch, R. Калорійне обмеження резус-мавп знижує окислювальну шкоду скелетних м'язів. FASEB J. 14, 1825–1836 (2000).

Sohal, R. S., Agarwal, S., Candas, M., Forster, M. J. & Lal, H. Вплив віку та обмеження калорій на окислювальну шкоду ДНК у різних тканинах мишей C57BL/6. Мех. Старіння Dev. 76, 215–224 (1994).

Feuers, R. J., Weindruch, R. & Hart, R. W. Калорійне обмеження, старіння та антиоксидантні ферменти. Mutat. Рез. 295, 191–200 (1993).

Хюн, Д.Х., Емерсон, С. Proc. Natl Акад. Наук. США 103, 19908–19912 (2006).

Де Кабо, Р. та ін. Обмеження калорій зменшує вікові зміни в антиоксидантній системі плазматичної мембрани печінки щурів. Досвід. Геронтол. 39, 297–304 (2004).

Guo, Z. M., Yang, H., Hamilton, M. L., VanRemmen, H. & Richardson, A. Вплив віку та обмеження їжі на окислювальне пошкодження ДНК та активність антиоксидантних ферментів в аорті миші. Мех. Старіння Dev. 122, 1771–1786 (2001).

Ся, Е., Рао, Г., Ван Реммен, Х., Гейдарі, А. Р. та Річардсон, А. Діяльність антиоксидантних ферментів у різних тканинах самців щурів Fischer 344 змінюється внаслідок обмеження їжі. Дж. Нутр. 125, 195–201 (1995).

Guo, Z., Heydari, A. & Richardson, A. Репарація ексцизії нуклеотидів активно транскрибованої та нетранскрибованої ДНК у гепатоцитах щурів: вплив віку та обмеження в харчуванні. Досвід. Клітинна Res. 245, 228–238 (1998).

Cabelof, D. C. та співавт. Калорійне обмеження сприяє розвитку геномної стабільності шляхом індукції відновлення базового висічення та скасування його вікового спаду. Ремонт ДНК 2, 295–307 (2003).

Гейдарі, А.Р., Уннікрішнан, А., Люсенте, Л.В. та Річардсон, А. Калорійне обмеження та геномна стабільність. Нуклеїнові кислоти Res. 35, 7485–7496 (2007).

Уайт, Р. Р. і Віджг, Дж. Дволанцюгові розриви ДНК сприяють старінню? Мол. Клітинка 63, 729–738 (2016).

Lee, J. E. та співавт. Обмеження калорій (CR) зменшує вікове занепад активності негомологічних кінцевих з’єднань (NHEJ) у тканинах щурів. Досвід. Геронтол. 46, 891–896 (2011).

Хм, J. H. та співавт. Специфічні для тканини зміни білка, що відновлює ДНК Ku та mtHSP70, у старіючих щурів та їх уповільнення обмеженням калорій. Мех. Старіння Dev. 124, 967–975 (2003).

Вайдя, А. та ін. Миші-репортери демонструють, що відновлення ДНК негомологічним кінцевим приєднанням зменшується з віком. PLoS Genet. 10, e1004511 (2014).

Кім, К. Х. та співавт. Короткочасне обмеження калорій покращує загальногеномні вікові зміни метилювання ДНК. Старіння клітини 15, 1074–1081 (2016).

Подяка

Ця робота була підтримана грантами Національного інституту охорони здоров’я В.Г. і як.

Інформація про автора

Приналежності

Департамент біології, Рочестерський університет, Рочестер, Нью-Йорк, 14627, США

Чжунхе Ке, Денис Фірсанов, Бріанна Спенсер, Андрій Селуанов і Віра Горбунова

Ви також можете шукати цього автора в PubMed Google Scholar

Внески

З.К., Д.Ф., А.С. та В.Г. розроблені дослідження; З.К., Д.Ф. та Б.С. проводили експерименти; З.К., А.С. та В.Г. проаналізував дані та написав статтю за участю всіх авторів.

Автори-кореспонденти

Декларації про етику

Конкуруючі інтереси

Автори декларують відсутність конкуруючих інтересів.

Додаткова інформація

Примітка видавця Springer Nature залишається нейтральним щодо юрисдикційних вимог в опублікованих картах та інституційних приналежностей.