Обсяг еякуляту серйозно занижується, коли сперма піпетується або декантується у циліндри з посудини для збору

Інститут репродуктивної медицини університету, Мюнстер, Німеччина

Тревор Г. Купер, Інститут репродуктивної медицини університету, Домагкштрассе 11, D ‐ 49129 Мюнстер, Німеччина (електронна пошта: [email protected]). Шукати інші статті цього автора

Центр охорони здоров'я та навколишнього середовища, Каліфорнійський університет, Девіс, Каліфорнія

Кафедра акушерства та гінекології, Рочестерський університет, Школа медицини та стоматології, Рочестер, Нью-Йорк

Центр охорони здоров'я та навколишнього середовища, Каліфорнійський університет, Девіс, Каліфорнія

Інститут репродуктивної медицини університету, Мюнстер, Німеччина

Центр охорони здоров'я та навколишнього середовища, Каліфорнійський університет, Девіс, Каліфорнія

Куточок лабораторії андрології: вітає подання небажаних рукописів, запитаних рецензій та статей у форматі дебатів. Рукописи будуть переглянуті та відредаговані редактором розділу. Усі подані матеріали слід надсилати до Журнал андрології Редакція. Заохочуються листи до редактора у відповідь на статті, а також пропоновані теми для майбутніх номерів.

Ця робота була підтримана грантами Національного інституту охорони здоров’я (R01 ‐ ES09916 для Університету Міссурі, MO1 ‐ RR00400 для Університету Міннесоти, MO1 ‐ RR0425 для Медичного центру Harbor UCLA) та грантом 18018278 від штату Айова до Університету Айови.

Два останні дослідження показали, що піпетування сперми з посудини для збору призводить до заниження приблизно 0,5 мл (діапазон 0,3–0,8 мл; Бразилія та ін., 2004; Івамото та ін., 2006) порівняно із зважуванням, проте відсутні дані про втрати утворюється при виливанні сперми в градуйовані балони. Оскільки площа контакту з боками посудини для збору при переливанні сперми в градуйований циліндр, швидше за все, буде набагато більшою, ніж під час піпетування, утримання в посудині може бути набагато більшим, що призведе до більшого заниження об'єму за допомогою цього методу. У цьому дослідженні отримані нові дані про втрату обсягу сперми під час декантації в циліндр і раніше опубліковані результати про втрати через піпетування, а щільність сперми повторно аналізується разом з додатковими даними.

Методи та перевірка обладнання

Сперма—

Дев'ять здорових донорів забезпечили сперму шляхом мастурбації в Каліфорнійському університеті, штат Девіс, лабораторія після принаймні 2 днів сексуального утримання. Крім того, дані попередніх публікацій з дослідження для майбутніх сімей (SFF), багатоцентрового дослідження якості сперми у фертильних чоловіків у Сполучених Штатах (Бразилія та ін., 2004), були повторно проаналізовані разом із даними майже 300 додаткових чоловіків з цього ж дослідження але які були зібрані після опублікованих аналізів для порівняння обсягу та піпетування. Для збору даних про вагу 1,0 мл сперми використовували підгрупу з 80 чоловіків.

Статистика—

Всі статистичні тести проводили за допомогою Sigma Stat (Еркрат, Німеччина) і статистичну значимість прийняли на P менше 0,05. Використання параметричних або непараметричних тестів було продиктовано природою нетрансформованих даних, а відповідні тести, що використовуються, згадуються в тексті. Якщо не зазначено інше, дані подаються як середнє значення ± SD, діапазон.

Точність обладнання -

Вага (Denver Instruments, Arvada, Colo) був точним до 210 г, і при його ввімкненні застосовувалося внутрішнє калібрування. Стандарти по 1, 2, 5 та 10 г зважували 10 разів, кожен раз після включення ваги. Середні ваги становили 0,999, 2,000, 4,999 і 9,999 г, з коефіцієнтами варіації 0,042%, 0,021%, 0,010% та 0,004%, відповідно. Середня точність залишку становила 99,9%.

Вага 35, 120 мл мл посудин для збору сперми становила 17,261 ± 0,667 г (діапазон 15,380–18,270 г, CV 3,8%), підкреслюючи необхідність зважувати кожен порожній посудину для збору сперми окремо і не приймати стандартну вагу для контейнера.

Пластикові 5,0-міліметрові піпетки (Фішер, Пітсбург, Пенсільванія) з градуюванням по 0,1 мл калібрували двома способами: спочатку відсмоктуванням води до лінії 3,0 мл, а потім її викиданням у таровані зважувальні човни, піпетки рівно 3 г води, а потім зчитування об'єму за шкалою піпетки. Кожну процедуру повторювали 10 разів. Вага рівно 3,0 мл води, виміряний за допомогою піпетки (2,989 ± 0,035 г, 2,935–3,057 г), становив 99,7% від очікуваної маси цього об’єму води (2,995) від її щільності (0,9982 г/мл при температура навколишнього середовища 20 ° C; Lentner 1981). Три грама води (2,999 ± 0,006 г, 2,990–3,010 г) відміряли до об’єму 3,0 ± 0,0 (3,0–3,1) мл, що становило 96,5% від об’єму, передбачуваного від її щільності (3,004 ± 0,006 мл, 2,955– 3,015 мл).

Піпетки позитивного переміщення (Microman M ‐ 1000, Oakland, Каліфорнія) були відкалібровані шляхом витіснення різних обсягів води в таровані зважувальні човни в 4 центрах SFF. В рамках регулярного контролю якості ваги рівно 100, 950, 1000 і 1900 мкл води (99,555 ± 1,372, 93,9–106,0; 954,613 ± 3,958, 934,5–953,3; 0,992 ± 0,005, 0,977–1,003; та 1893,613 ± 3,771, 1886,0–1901,0 мг відповідно) являли собою середнє відновлення 99,6% очікуваної ваги цього об’єму води, розрахованого з урахуванням її густини.

Скляні вимірювальні балони об'ємом 10,0 мл (Pyrex, Acton, Mass) з градуюваннями по 0,1 мл калібрували 2 методами. У першому 3 г води (дозованої у зважувальні катери) переносили в балони, і об’єм зчитували зі шкали циліндрів. Під час перенесення не спостерігалося втрат води. При другому способі до попередньо зважених балонів, які потім повторно зважували, додавали рівно 3,0 мл води, як визначено з градуювання циліндрів. Кожну процедуру повторювали 10 разів. Очікуваний об'єм цієї маси 3 г води, розрахований на основі перенесеної маси (3,013 ± 0,013, 2,990–3,030 мл) і припускаючи щільність води 1,00 г/мл, або використовуючи 0,9982 г/мл (3,018 ± 0,013, 2,995–3,0335 мл), становив 99,4% від вимірюваного об’єму (3,0 ± 0,1, 2,9–3,1 мл). Вага 3,0 мл води (2,976 ± 0,055, 2,880–3,080 г) становила 99,6% від ваги, передбаченої від її щільності (2,965 г).

Експерименти та результати

Порівняння зважування та піпетування на обсязі сперми—

Зразки сперми у 803 чоловіків із ССФ (1 або 2 на людину) збирали безпосередньо в одноразові посудини для збору, які попередньо зважували. Порожній контейнер містив етикетку з інформацією випробуваного, на якій реєструвалася вага судна. Посудина закупорювалася під час зрідження при кімнатній температурі і знову зважувалася після зрідження. Протягом 20-30 хвилин еякуляції контейнер для зразка був перекинутий приблизно до 45 ° так, щоб сперма збиралася біля основи/збоку під кутом для полегшення піпетування. Насінну речовину всмоктували в піпетку за допомогою піпеточного насоса (Fisher), з належною обережністю видаляли всю сперму після очікування, поки вона накопичиться в куті контейнера. Обсяг оцінювали з точністю до 0,1 мл.

Обсяг 1429 проб сперми від 803 чоловіків у 4 центрах США розраховували за вагою зразків. Чи вважали щільність сперми 1,0 г/мл (3,888 ± 1,682, 0,120–11,470 мл), 0,9882 г/мл (3,895 ± 1,685, 0,120–11,491 мл) або 1,014 г/мл (оцінювали щільність сперми нижче: 3,834 ± 1,659, 0,118–11,312 мл), об’єм за вагою був значно більшим (тест підписаний Уілкоксоном), ніж вимірюваний піпеткою (3,4 ± 1,6, 0,1–10,6 мл). Середня різниця (припускаючи щільність 1 г/мл) становила 0,500 ± 0,266 мл (–0,600–2,890 мл). Виміряно лише 5 зразків (0,3%), що мали більші обсяги шляхом піпетування, ніж зважування, і лише 3 зразки (0,2%) мали обсяги від зважування, що перевищували обсяги шляхом піпетування більше, ніж на 2,0 мл. Ступінь збитків становила 14,3 ± 8,3% (–20,0% –75,0%), причому більші відсотки помилок пов’язані з меншими обсягами сперми.

Порівняння зважування та декантації в циліндр за обсягом сперми—

Було проведено два експерименти: перший, що імітував нормальну лабораторну обробку судин, а другий з більш ретельним протоколом поводження, коли сперму виливали безпосередньо на дно контейнера для зразків, призначеного для мінімізації контакту сперми з бортами посудини для збору до вимірювання. Для нормальної лабораторної роботи сперму збирали безпосередньо у зважені одноразові посудини для збору, як зазначено вище. Після зрідження та зважування сперму виливали в градуйований циліндр. Було надано достатньо часу, щоб сперма стікала з посудини в циліндр (10 секунд), і останні краплі збирали, постукуючи посудиною для збору об губу циліндра. Перед тим, як зняти показники об’єму, спермі було дозволено стікати зі стінок балона. Обсяг зчитували з меніска з точністю до 0,1 мл. Після видалення максимальної кількості сперми таким способом посудину для збору повторно зважували, щоб встановити кількість залишкової сперми, що залишилася в посудині після декантування її вмісту.

Обсяг 44 зразків сперми, розрахований на основі ваги, що передбачає щільність 1,0 г/мл (3,108 ± 0,977, 1,200–5,010 г), 0,9982 г/мл (3,113 ± 0,979, 1,202–5,019 г) або 1,014 г/мл (3,065 ± 0,963, 1,1783–4,941 г) був значно більшим (у парі т тест), ніж вимірюваний на градуйованому циліндрі (2,7 ± 0,9, 0,8–4,5 мл). Середня різниця (припускаючи щільність 1 г/мл) становила 0,377 ± 0,150 (0,100–0,78) мл. Ступінь втрати знаходилась у межах 3,3% -39,4% (12,9 ± 6,3%) від обсягу, оціненого зважуванням. Ця оцінка втрат, отримана в результаті порівняння виміряних обсягів та ваги, була значно більшою (в парі т тест), ніж ступінь втрати, визначена від маси залишкової сперми в посудині для збору після декантирування (0,321 ± 0,104, 0,130-0,600 мл).

З 27 зразків, в яких використовувались звичайні лабораторні умови, втрата сперми була значно більшою (т тест; 0,427 ± 0,151, 0,0200–0,780 мл), ніж тоді, коли вживали заходів обережності (n = 17), щоб уникнути надмірного контакту насінної рідини з боками посудини перед декантацією (0,297 ± 0,111, 0,10–0,490 мл). Залишкові втрати насінної рідини (0,368 ± 0,099, 0,170–0,600 мл) також були більшими, ніж при більш обережному ставленні до зразків (0,242 ± 0,052, 0,130–0,350 мл).

Щільність сперми—

Щільність сперми вимірювали зважуванням 1,0 мл, розподіленої за допомогою піпетки з позитивним переміщенням, у таровані зважувальні човни. Вісімдесят зразків сперми з 4 різних центрів SFF мали середню щільність 1,014 ± 0,0133, 0,970–1,043 г/мл. Оцінки між центрами суттєво не відрізнялись.

Порівняння зважування, піпетування та використання градуйованого балона на обсязі сперми—

Об’єм сперми, який оцінювали шляхом зважування посудини для збору до та після збору еякуляту та припускаючи, що її щільність дорівнює 1 г/мл, був постійно більшим, ніж об’єм, оцінений за допомогою вимірювання його об’єму піпеткою або виливання у градуйований циліндр. Це показано на малюнку, на якому різниця між вагами побудована щодо середньої ваги порівняних методів (Bland and Altman, 1995). Занижений об’єм сперми шляхом перенесення зразка з посудини для збору в циліндр (0,427 мл) був значно нижчим (тест рангової суми Манна-Уїтні), ніж втрати, спричинені піпетуванням із посудини (0,500 мл). Для обох методів фактичне заниження обсягу сперми позитивно пов’язане з об’ємом сперми, оціненим зважуванням, хоча при вираженні у відсотках від загального обсягу було виявлено збільшення втрат при меншому обсязі сперми (дані не наведені).

Обговорення

Це дослідження показало, що послідовне і значне зменшення обсягу сперми досягається, коли піпетка або градуйований циліндр використовується для вимірювання скрапленої сперми, що переноситься з її посудини для збору. Ці втрати не можуть бути враховані випаровуванням, оскільки зразки закривались під час зрідження при кімнатній температурі та піпетували або декантували відразу після зважування. Можливо, що при особливо в'язких зразках перенесення призведе до ще менших обсягів, оскільки більше буде затримуватися на боці посудини для декантування, а деякі можуть прилипати до боків циліндра. Різниця в оцінках обсягу сперми шляхом зважування та піпетування повідомлялася раніше (Brazil et al, 2004; Iwamoto et al, 2006), але були вказані лише середні значення. У цьому дослідженні втрата сперми була подібною (~ 0,5 мл) і становила в середньому 14% втрати обсягу. Нові дані про втрату сперми, пов'язані з виливанням у градуйований циліндр, виявили подібне заниження обсягу сперми (~ 0,4 мл), що представляло подібний відсоток втрати сперми (13%).

Iwamoto та співавт. (2006) використовували виміряну середню різницю (0,49 мл) для корекції обсягів сперми для порівняння результатів з іншими дослідженнями, в яких зважування використовувалось для оцінки обсягу сперми. Йоргенсен та співавт. (1997) повідомили лабораторії, які вважали, що 0,1 мл сперми залишали після декантування у градуйовану пробірку і додавали це значення до виміряного об'єму. Результати цього дослідження припускають, що така процедура корекції може привести до ще більших помилок, оскільки діапазон втрат значно варіюється, можливо, пов'язаний із властивою в'язкістю зразка або поводженням із зразком після збору, і, таким чином, аргументує проти цієї практики.

Щільність людської сперми була опублікована раніше (Huggins et al, 1942; Brazil et al, 2004), але знову ж повідомлялося лише про середні значення. Повторний аналіз даних Бразилії та співавт. (2004) та аналіз додаткових зразків дав значення, дещо нижчі за середнє значення, повідомлене Хаггінс та співавт. (1942), для яких не було надано детальної інформації про методологію. Щільність води, встановлена точно таким же методом, була близькою до тієї, що була зареєстрована для води при 20 ° C (Lentner 1981), що підтверджує точність значення. Таким чином, коефіцієнта 1,00 достатньо для оцінки обсягу сперми за вагою.

Обсяг сперми найкраще вимірювати зважуванням зразка в посудині для збору (і припускаючи щільність 1 г/мл, що дуже близько до виміряного значення 1,014 г/мл), а не піпетуванням або декантацією сперми в градуйований циліндр, оскільки цей подальший перехід на вимірювальні прилади призводить до заниження обсягу, що порушить точність загальної кількості сперматозоїдів або інших клітин в еякуляті.