In vitro антикандидна ефективність Syzygium aromaticum (гвоздика) екстракти проти вагінального кандидозу

Анотація

Передумови

Кандидозний вагініт - це глобальна небезпека для здоров’я, яка збільшує захворюваність серед жінок дітородного віку. Недавні дослідження показали високий рівень резистентності до наркотиків Кандида штами. Крім того, лікування вульвовагініту Candida під час вагітності є складним завданням, оскільки протигрибкова терапія пов’язана з патологіями плода. Отже, важливо розробити нові терапевтичні стратегії лікування вульвовагінального кандидозу.

Методи

У цьому дослідженні ми використовували метод дифузії диска для оцінки антикандидної активності різних Syzygium aromaticum екстракти (метанол, етилацетат, н-гексан та діетиловий ефір) проти C. albicans, C. glabrata, і C. tropicalis. Крім того, газова хроматографія-мас-спектрометрія (GC-MS) аналізують різні S. aromaticum екстракти проводили для визначення активних компонентів, що виявляють антикандидальну активність. Оцінювали цитотоксичність різних екстрактів гвоздики проти клітинної лінії HUH7.

Результати

Етилацетатний екстракт виявляв найвищу протигрибкову активність проти C. albicans, C. glabrata, і C. tropicalis з діаметром зони гальмування відповідно 20,9, 14,9 та 30,7 мм. Мінімальна інгібуюча концентрація S. aromaticum етилацетатний екстракт становив 250 мкг/диск проти C. tropicalis, і 500 мкг/диск проти C. albicans і C. glabrata, тоді як мінімальна фунгіцидна концентрація становила 0,5 мг/диск проти C. tropicalis і 1 мг/диск проти C. albicans і C. glabrata. GC-MS аналіз екстракту етилацетату виявив основну біоактивну сполуку як евгенол (58,88%), потім евгенілацетат (23,86%), транс-каріофілен (14,44%) та α-гумулен (1,88%). Аналіз цитотоксичності показав, що екстракт діетилового ефіру продемонстрував найнижчий токсикологічний ефект проти клітинної лінії HUH7, з відносною IC50 62,43 мкг/мл; метанольний екстракт продемонстрував більш високу токсичність (IC50, 24,17 мкг/мл).

Висновок

Як S. aromaticum екстракт виявляв високу протигрибкову активність при низьких концентраціях, він може бути потенційним джерелом природних протигрибкових препаратів.

Передумови

Методи

Приготування рослинних екстрактів

Процедуру екстракції проводили з використанням різних органічних розчинників (метанол, етилацетат, діетиловий ефір та н-гексан), демонструючи різні полярності, щоб забезпечити екстракцію всіх гідрофільних та ліпофільних біоактивних сполук. Квіткові бруньки S. aromaticum були отримані з місцевого ринку в Ер-Ріяді, Саудівська Аравія. Ми виявили рослинний матеріал, ідентифікацію підтвердив Саудівський гербарій, Департамент ботаніки, Науковий коледж, Університет короля Сауда. Рослинний матеріал був депонований у гербарії з номером ваучера (KSU-14682). Бруньки гвоздики дезінфікували, використовуючи 0,5% розчин гіпохлориту натрію (NaOCl), промивали три рази підряд стерильною дистильованою водою і давали висохнути. Висушений рослинний матеріал однорідно подрібнювали за допомогою механічного розчину. Порошкоподібний зразок (15 г) додавали до 200 мл різних органічних розчинників та інкубували на магнітній мішалці протягом 48 год. Далі суміш центрифугували при 9000 об/хв протягом 10 хв для видалення залишків. Надосадову рідину фільтрували за допомогою фільтрувального паперу ватмана для отримання прозорого фільтрату. Фільтрат концентрували за допомогою ротаційного випарника і зберігали при 4 ° C до використання. Вихід екстракту розраховували за такою формулою:

де R - маса залишку рослинного екстракту; S - маса сировини зразка рослини.

Ізоляти кандиди

Три Кандида видів, C. albicans, C. tropicalis, і C. glabrata були отримані з лікарні короля Халіда, Ер-Ріяд, Саудівська Аравія. Свіжий посівний матеріал готували шляхом субкультури кожного Кандида видів на середовище декстрозного агару Сабуро (SDA) при 35 ° C протягом 48 годин.

Приготування кандидозного посіву

Нахили SDA готували та інокулювали різними Кандида видів. Гриб збирали за допомогою 5 мл стерильного сольового розчину. Абсорбцію грибкової суспензії вимірювали при 560 нм за допомогою спектрофотометра, і кількість клітин регулювали, щоб досягти життєздатної кількості клітин 10 7 КУО/мл для кожного Кандида видів.

Антикандидальний біопроб

Визначення мінімальної інгібуючої концентрації (MIC)

MIC визначали як найнижчу концентрацію рослинного екстракту, що виявляє протигрибкову активність. MIC оцінювали лише для етилацетатного екстракту S. aromaticum як найефективніший екстракт гвоздики. Середовище SDA (15 мл) виливали в стерильну чашку Петрі у вигляді базального шару з подальшим додаванням 10 мл засіяного середовища (як описано вище) і давали застигнути. Стерильні фільтрувальні паперові диски (діаметром 8 мм), завантажені з різною концентрацією S. aromaticum етилацетатний екстракт (0,125, 0,25, 0,50, 1,0, 2,0 та 4,0 мг/диск) поміщали на засіяне середовище. Пластини інкубували при 5 ° C, щоб забезпечити дифузію екстракту. Потім пластини інкубували при температурі 35 ° С протягом 48 годин і діаметр зони інгібування вимірювали за допомогою штангенциркуля. Найнижча концентрація, яка виявляла протигрибкову активність проти Кандида виду було зареєстровано як MIC.

Визначення мінімальної фунгіцидної концентрації

Мінімальна фунгіцидна концентрація (MFC) визначалася як найнижча концентрація екстракту гвоздики, що виявляє фунгіцидну активність. Смуги, отримані з зони гальмування MIC, та дві послідовні концентрації культивували на свіжоприготовлених планшетах SDA. Пластини інкубували при температурі 35 ° C протягом 48 годин, і найменшу концентрацію, яка не виявляла зростання грибків, реєстрували як MFC.

Газова хроматографія-мас-спектрометрія (GC-MS) аналіз S. aromaticum екстракти

Фітохімічний аналіз S. aromaticum екстракти проводили за допомогою GC-MS для виявлення активних сполук, що виявляють протигрибкову активність. Аналіз GC-MS проводили за допомогою GC-MS Thermo Trace GC Ultra/TSQ Quantum GC. Фітохімічний аналіз проводили за допомогою капілярної колонки TR5-MS (30 м × 0,25 мм; товщина плівки 0,25 мкм). Піч була запрограмована на швидкість 6 ° C/хв для підвищення температури з 40 до 200 ° C. Умови експлуатації були такими: гелій як газ-носій зі швидкістю потоку 1 мл/хв, температура інжектора та детектора 250 ° C, коефіцієнт розщеплення 1:50. Умови мас-спектрометрії були такими: діапазон мас від m/z, 40–400 аму; потенціал іонізації 70 еВ; електронний множник енергії 2000 В. Хімічні складові екстрактів бутонів гвоздики були ідентифіковані шляхом порівняння результатів GC-MS аналізу з еталонними даними про час утримання та спектральними масами бази даних NIST.

Аналіз цитотоксичності

Статистичний аналіз

Сприйнятливість Кандида до різних екстрактів гвоздики аналізували за допомогою GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу та тесту Тукі. Дані представлені як середнє значення ± стандартна похибка для трьох примірників. Дані вважалися статистично значущими, коли P-значення було менше 0,05.

Результати

Урожай екстракту

Висока S. aromaticum Вихід екстракту (6,09%) отримували з використанням діетилового ефіру, потім метанолу (4,67%), н-гексану (3,02%) та етилацетату (2,57%).

Антикандидна активність

MIC та MFC S. aromaticum екстракт етилацетату

MIC S. aromaticum етилацетатний екстракт проти C. tropicalis становив 0,25 мг/диск з діаметром зони гальмування 8,4 мм. ВПК проти C. albicans і C. glabrata становив 0,5 мг/диск з діаметром зони гальмування 8,83 та 8,07 мм відповідно (табл. 2). MIC S. aromaticum етилацетатний екстракт проти C. tropicalis було нижчим, ніж у обох C. albicans і C. glabrata. Отже, C. tropicalis найбільш чутливий до цього екстракту гвоздики (рис. 1). МФЦ S. aromaticum екстракт проти C. tropicalis становив 0,5 мг/диск, як відсутність зростання Кандида спостерігався при цій концентрації. Так само ні C. albicans і C. glabrata ріст спостерігався при дозі 1 мг/диск.

Мінімальна інгібуюча концентрація S. aromaticum етилацетатний екстракт проти Кандида видів

Газова хроматографія-аналіз мас-спектрометрії (GC-MS) S. aromaticum екстракти

GC-MS аналіз S. aromaticum екстракт етилацетату виявив, що найпоширенішим активним компонентом є евгенол (58,88%), за яким слідують евгенілацетат (23,86%), транс-каріофілен (14,44%), α-гумулен (1,88%), оксид каріофілену (0,74%) і лонгіпінокарвон (0,19%) (таблиця 3 та рис. 2). Крім того, основним біоактивним компонентом екстракту діетилового ефіру був евгенол (66,48%), а потім евгенілацетат (31,73%), транс-каріофілен (1,63%), оксид каріофілену (0,31%) та α-гумулен (0,21%) (Таблиця 4 та Рис. 3). На відміну від них, нові фітохімічні складові, виявлені в S. aromaticum екстракт метанолу включав кетон мускусу (2,78%), α-кубебене (0,79%), хавікол (0,78%), β-кадінен (0,59%) та α-фарнезен (0,37%). Також були виявлені інші складові, такі як евгенол (55,58%), евгенілацетат (19,83%), транс-каріофілен (15,71%), α-гумулен (2,46%) та оксид каріофілену (1,10%) (табл. 5 та рис. 4 ). Подібним чином евгенол (61,37%) був найпоширенішим біоактивним компонентом екстракту н-гексану (таблиця 6 та рис. 5).

Хроматограма S. aromaticum екстракт етилацетату

Хроматограма S. aromaticum екстракт діетилового ефіру

Хроматограма S. aromaticum метанольний екстракт

Хроматограма S. aromaticum екстракт н-гексану

Аналіз цитотоксичності

Екстракт гвоздики діетилового ефіру продемонстрував найнижчу токсичну дію проти клітинної лінії HUH7 із відносним IC50 62,43 мкг/мл, тоді як більшу токсичність виявлено з метанольним екстрактом, з IC50 24,17 мкг/мл Більше того, екстракти н-гексану та етилацетату гвоздики виявляли помірну токсичність щодо клітин HUH7 із відносними значеннями IC50 42,19 та 33,68 відповідно (рис. 6).

IC50 різних екстрактів гвоздики проти клітинної лінії HUH7

Обговорення

Висновок

Syzygium aromaticum екстракти виявляли високу протигрибкову ефективність проти найбільш поширених і переважаючих штамів, що викликають кандидозний вагініт. Етилацетат був найефективнішим органічним розчинником у процесі екстракції, забезпечуючи високий вихід активних компонентів гвоздики. Крім того, результати продемонстрували високу ефективність екстракту гвоздики порівняно з тербінафіном (контроль). Отже, його можна використовувати як природний, безпечний та ефективний протигрибковий засіб. Більше того, він може бути призначений як замінник декількох хіміотерапевтичних засобів, що застосовуються при терапії кандидозного вагініту для зовнішнього застосування, усуваючи великі побічні ефекти, пов'язані з цими хімічними агентами, особливо у вагітних.

Наявність даних та матеріалів

Набори даних, які використовувались та/або аналізували під час поточного дослідження, можна отримати у відповідного автора за обґрунтованим запитом.