HER2-специфічний цільовий токсин DARPin-LoPE: імуногенність та протипухлинний ефект на внутрішньоочеревинну модель ксенотрансплантата раку яєчників

Цільовий токсин DARPin-LoPE та його цитотоксичність щодо 2D та 3D моделей карциноми людини in vitro. (А) Конструкція гена, що кодує DARPin-LoPE. DARPin (темно-зелений), HER2-специфічний DARPin9,29; LoPE (фіолетовий), усічений екзотоксин Pseudomonas A, позбавлений доменів Ia, Ib, більшості епітопів домену II та В-клітин людини; His6 (світло-зелений), С-кінцевий гексагістидиновий мітка; K (оранжевий), послідовність KDEL. Злитий ген знаходиться під контролем промотора Т7; (B) Відносна життєздатність HER2-позитивних клітин аденокарциноми яєчників людини SKOV3.ip1 у 2D-одношаровій культурі (аналіз МТТ) після 72-годинної обробки різними концентраціями DARPin-PE40 (чорні кола) або DARPin-LoPE (прозорі трикутники); (C) Відносний об’єм 3D-сфероїдів HER2-позитивних клітин аденокарциноми яєчників людини SKOV-kat після 96 год лікування різними концентраціями DARPin-LoPE. Дані представлені як середнє значення ± SEM. "*" Позначає значення, яке суттєво відрізняється від відповідного контрольного значення при p n = 6).

Схема дослідження загальної токсичності та імуногенності DARPin-LoPE та DARPin-PE40. «0» означає аналіз параметрів, вивчених у тварин до початку курсу лікування. День першої ін'єкції цільових токсинів був встановлений як день 1. Лікування цільовими токсинами проводилося двома курсами по чотири ін'єкції через день, з перервою в один місяць між курсами, тобто в дні 1, 3, 5, 7 (перший курс) та 40, 42, 44 та 46 (другий курс). Лейкоцити аналізували за допомогою проточної цитометрії на 8 та 17 день після початку кожного курсу (тобто на 8, 17, 47 та 56 дні, позначені червоним кольором). Активність аланінамінотрансферази (ALT) та аспартатамінотрансферази (AST) у сироватці крові вимірювали на 6 та 18 день після початку кожного курсу (тобто на 6, 18, 45 та 57 дні, позначені синім кольором). Тест на титр антитіл проводили через два і три тижні після закінчення першого курсу лікування та через два та п’ять тижнів після закінчення другого курсу лікування (тобто на 20, 27, 60 та 80 дні, позначені зеленим кольором). Тварин евтаназували на 90 день, а органи відбирали для гістологічного дослідження (позначені чорним кольором).

Середня вага мишей у різних групах. Дні цільових ін'єкцій токсинів позначені стрілками (4 ін'єкції на курс, 2 курси). PBS, миші, оброблені забуференним фосфатом сольовим розчином (контрольна група); DARPin-LoPE 4 × 10 мкг, миші, які отримували 10 мкг DARPin-LoPE протягом 4 доз через день (40 мкг на курс, загалом 80 мкг); DARPin-LoPE 4 × 20 мкг, миші, які отримували 20 мкг DARPin-LoPE протягом 4 доз через день (80 мкг на курс, загалом 160 мкг); DARPin-PE40 4 × 10 мкг, миші, які отримували 10 мкг DARPin-PE40 протягом 4 доз через день (40 мкг на курс, загалом 80 мкг). Дані представлені як середнє значення ± SEM. "*" Позначає значення, яке суттєво відрізняється від відповідного контрольного значення при p n = 5).

Фарбування гематоксиліном та еозином зрізів органів мишей у різних групах. Дегенеративні ураження тканин при обробці цільовими токсинами позначаються стрілками. У мишей, які отримували 4 × 10 мкг DARPin-PE40, частина білої пульпи селезінки збільшена в зоні периартеріолярних оболонок. У мишей, які отримували 4 × 10 мкг DARPin-PE40 або 4 × 20 мкг DARPin-LoPE, перибронхоскулярний простір розширено в легенях, а також спостерігаються місця крововиливу та некрозу в нирках. Для зображень селезінки смуга шкали становить 200 мкм, збільшення × 100; для шкали легенів, нирок, серця та печінки шкала становить 100 мкм, збільшення × 200.

Динаміка титрів антитіл, специфічних для цільових токсинів. День першого введення цільових токсинів був встановлений як день 1. 0 для вимірювання титрів антитіл у сироватці мишей перед початком першого курсу лікування. PBS, миші, оброблені забуференним фосфатом сольовим розчином (контрольна група); DARPin-LoPE 4 × 10 мкг, миші, які отримували 10 мкг DARPin-LoPE протягом 4 доз через день (40 мкг на курс, загалом 80 мкг); DARPin-LoPE 4 × 20 мкг, миші, які отримували 20 мкг DARPin-LoPE протягом 4 доз через день (80 мкг на курс, загалом 160 мкг); DARPin-PE40 4 × 10 мкг, миші, які отримували 10 мкг DARPin-PE40 протягом 4 доз через день (40 мкг на курс, загалом 80 мкг). "*" Позначає значення, яке суттєво відрізняється від значення відповідного контролю (PBS) при ppn = 5). Дані представлені як середнє значення ± SEM.

Флуоресцентні клітини раку яєчників людини SKOVip-kat та їх реакція на лікування DARPin-LoPE in vitro. (A) Візуалізація клітин SKOVip-kat, що експресують білок Katushka (червоний) у пропусканому світлі (зверху) та за допомогою конфокальної мікроскопії (знизу). Розмір зображення 135 × 135 мкм; (B) Аналіз поверхневого вмісту білка HER2 на клітинах SKOVip-kat, забарвлених міченим FITC антитілом до HER2 (червоне заповнення) або ізотопним контролем, міченим FITC (синє наповнення), та аналізований за допомогою проточної цитометрії; (C) Відносна життєздатність клітин SKOVip-kat у 2D одношаровій культурі (аналіз МТТ) після 72 год обробки різними концентраціями DARPin-LoPE. Дані представлені як середнє значення ± SEM.

Дослідження in vivo DARPin-LoPE проти ксенотрансплантатів флуоресцентної пухлини SKOVip-kat у мишей, що перебувають на тиму. (А) Схема експерименту. День i.p. щеплення тваринам 4 × 10 6 клітин SKOVip-kat встановлювали як день 1; (B) Послідовні флуоресцентні зображення in vivo очеревини контрольних мишей (ін’єкція PBS) та мишей, оброблених 5 × 10 мкг DARPin-LoPE. Двовимірні флуоресцентні зображення in vivo отримували за допомогою установки флуоресцентного зображення всього тіла із плоскою геометрією епіосвітлення. Розмір зображення 3 × 5 см; (C) Прогресія пухлини, виміряна за допомогою флуоресцентної візуалізації всього тіла in vivo у тварин, які отримували PBS (контроль, чорна крива), 5 × 5 мкг DARPin-LoPE (синя крива) або 5 × 10 мкг DARPin-LoPE (червона крива). Дні цільових ін’єкцій токсину позначені стрілками; (D) коефіцієнт швидкості росту пухлини (k) у різних груп тварин; (E) Час подвоєння пухлини у різних груп тварин. Дані представлені як середнє значення ± SEM. "*" Позначає значення, яке суттєво відрізняється від відповідного контрольного значення при p n = 5–8).

Анотація

Схема дослідження загальної токсичності та імуногенності DARPin-LoPE та DARPin-PE40. «0» означає аналіз параметрів, що вивчались у тварин до початку курсу лікування. День першої ін'єкції цільових токсинів був встановлений як день 1. Лікування цільовими токсинами проводилося двома курсами по чотири ін'єкції через день, з перервою в один місяць між курсами, тобто на 1, 3, 5, 7 (перший курс) та 40, 42, 44 та 46 (другий курс). Лейкоцити аналізували за допомогою проточної цитометрії на 8 та 17 день після початку кожного курсу (тобто на 8, 17, 47 та 56 дні, позначені червоним кольором). Активність аланінамінотрансферази (ALT) та аспартатамінотрансферази (AST) у сироватці крові вимірювали на 6 та 18 день після початку кожного курсу (тобто на 6, 18, 45 та 57 дні, позначені синім кольором). Тест на титр антитіл проводили через два і три тижні після закінчення першого курсу лікування та через два та п’ять тижнів після закінчення другого курсу лікування (тобто на 20, 27, 60 та 80 дні, позначені зеленим кольором). Тварин евтаназували на 90 день, а органи відбирали для гістологічного дослідження (позначені чорним кольором).

Середня вага мишей у різних групах. Дні цільових ін'єкцій токсинів позначені стрілками (4 ін'єкції на курс, 2 курси). PBS, миші, оброблені забуференним фосфатом сольовим розчином (контрольна група); DARPin-LoPE 4 × 10 мкг, миші, які отримували 10 мкг DARPin-LoPE протягом 4 доз через день (40 мкг на курс, загалом 80 мкг); DARPin-LoPE 4 × 20 мкг, миші, які отримували 20 мкг DARPin-LoPE протягом 4 доз через день (80 мкг на курс, загалом 160 мкг); DARPin-PE40 4 × 10 мкг, миші, оброблені 10 мкг DARPin-PE40 протягом 4 доз через день (40 мкг на курс, загалом 80 мкг). Дані представлені як середнє значення ± SEM. "*" Позначає значення, яке суттєво відрізняється від відповідного контрольного значення при p n = 5).