Межі в ендокринології

Клітинна ендокринологія

Завантажити статтю
- Завантажте PDF
- ReadCube
- XML (NLM)
- Додаткові
  Матеріал
Експортне посилання
- EndNote
- Довідковий менеджер
- Простий текстовий файл
- BibTex

ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

Кафедра фармакотерапії, Вища школа біомедичних наук, Університет Хіросіми, Мінамі-ку, Хіросіма, Японія

Все більше доказів вказує на те, що стрес ендоплазматичної сітки (стрес ER) бере участь у розвитку метаболічного синдрому. Однак фармакологічні методи лікування, спрямовані на стресовий стан, недостатньо зрозумілі. У цьому дослідженні ми виявили, що флувоксамін, селективний інгібітор зворотного захоплення серотоніну, що застосовується при депресії, може послабити індуковану стресом ER “стійкість до лептину”, тобто нечутливість до гормону лептину проти ожиріння. Лікування тунікаміцином, реагентом, що викликає стрес, спричинило загибель клітин, що суттєво пригнічувалося флувоксаміном. Лептин активує передачу сигналів JAK2 – STAT3. Стрес ER викликав порушення фосфорилювання STAT3, спричиненого лептином, яке було скасовано флувоксаміном. Флувоксамін був би новим чутливим до лептину лікарським засобом, який орієнтується на стресовий стан.

Вступ

Матеріали і методи

Матеріали та реагенти

Тунікаміцин отримували від компанії Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Японія). Лептин і флувоксамін були отримані від SIGMA (Сент-Луїс, Міссурі, США).

Культура клітин

Клітини людської нейробластоми SH-SY5Y підтримувались у модифікованому середовищі Орла Дульбекко, доповненому 10% (об/об) інактивованою тепловою сироваткою плоду теляти при 37 ° С у зволоженому 5% СО2 та 95% повітрі.

Генерація клітин, трансфікованих рецептором лептину Ob – Rb

Конструкція людського рецептора лептину Ob – Rb, подарунок від Genentech Inc., була трансфікована в клітину SH-SY5Y та HEK293 з використанням реагенту Lipofectamine Plus (Life Technologies Inc.) відповідно до інструкцій виробника. Стабільні трансфектанти (клітини SH-SY5Y – Ob – Rb та HEK293 – Ob – Rb) отримували шляхом відбору з антибіотиком G418 (Hosoi et al., 2006).

Вестерн-блот-аналіз

Вестерн-блот проводили, як описано раніше (Hosoi et al., 2010a, b). Клітини промивали крижаним PBS і лізували в буфері, що містив 10 мМ HEPES – NaOH (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ Na3VO4, 10 мМ NaF, 10 мкг/мл апротиніну, 10 мкг/мл лейпептину, 1 мМ фенілметилсульфонілфториду (PMSF) та 1% NP-40 протягом 20 хв. Лізат центрифугували при 15000 об/хв протягом 20 хв при 4 ° С і збирали супернатант. Зразки кип'ятять буфером Леммлі протягом 3 хв, фракціонують електрофорезом додецилсульфат натрію-поліакриламіду в гелі (SDS-PAGE) і переносять при 4 ° C в нітроцелюлозні мембрани. Мембрани інкубували з антифосфо STAT3 (Tyr705: сигналізація клітин; 1: 1000), анти STAT3 (Санта-Крус; 1: 1000), анти-KDEL (StressGen; 1: 1000) та анти-PARP (Санта-Крус; розведені до 1: 1000) антитіла з наступним антитілом до пероксидази, пов’язаним з хроном. Пероксидазу виявляли хемілюмінесценцією з використанням вдосконаленої системи хемілюмінесценції.

Експеримент з RNAi

Перехідні трансфекції siРНК проводили в клітинах HEK293-Ob – Rb. Ліпофектамін RNAiMAX (технології Life) використовувався для трансфекції siRNA відповідно до вказівок виробника. Для трансфекції використовували середовище Opti-MEM1, і кінцеві концентрації siРНК становили 50 нМ. Ми збили Sig-1R, використовуючи наступну послідовність siRNA: Sig-1R людини; 5′-CUC ACU AAC UGA GGC CUU UdTdT-3 ′. Ми використовували MISSION siRNA Universal Negative Control (SIGMA; SIC-001) для контрольної трансфекції міРНК. Клітини збирали через 72 год після трансфекції.

Аналіз витоку лактатдегідрогенази

Життєздатність клітин оцінювали методом витоку лактатдегідрогенази (ЛДГ), використовуючи набір для виявлення цитотоксичності (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) відповідно до вказівок виробника. Активність LDH вимірювали як оптимальну щільність при 492 нм.

Тварини

ob/ob Мишей отримували з японської SLC (Хамамацу, Японія). Мишей утримували в кімнаті при температурі 22–24 ° C у постійному денно-нічному ритмі та давали їжу та воду, ad libitum. Усі експерименти на тваринах проводились відповідно до Керівництва NIH з догляду та використання лабораторних тварин та схвалено комітетом з догляду та використання тварин в Університеті Хіросіми.

Вимірювання споживання їжі

Дев'ять тижнів жіночих мишей об/об утримували індивідуально до цього експерименту. Через три дні після виділення фізіологічний розчин (5 мл/кг) як манекен вводили внутрішньочеревно (внутрішньовенно) протягом 3 днів, а потім ми вводили лептин (1 мг/кг, внутрішньовенно) і/або флувоксамін (20 мг/кг). Всі процедури розпочали о 18:00. Вимірювання кумулятивного споживання їжі проводили шляхом вимірювання ваги їжі в конкретні моменти часу.

Статистика

Результати виражаються як середнє значення ± SE. Статистичний аналіз проводили за допомогою Стьюдента т-тест.

Результати

Флувоксамін, ослаблений ендоплазматичним ретикулумом, спричинений стресовою загибеллю клітин

Оскільки флувоксамін має спорідненість до Sig-1R (Narita et al., 1996), а Sig-1R бере участь у стресі ER (Hayashi and Su, 2007), ми проаналізували, чи може флувоксамін послабити стрес ER. Тунікаміцин (Tm) використовувався для специфічної індукції стресу ER. Як показано на малюнку 1, ми спостерігали збільшення GRP78 у клітинах, оброблених тунікаміцином, що вказує на стрес ER. Крім того, лікування тунікаміцином спричиняло розщеплення PARP (рис. 1) та загибель клітин, як оцінювали за допомогою аналізу витоку LDH (рис. 2). Результати дозволяють припустити, що тунікаміцин індукує викликаний стресом апоптоз в клітинах нейробластоми SH-SY5Y людини. Щоб оцінити фармакологічні властивості флувоксаміну, ми далі проаналізували його вплив на спричинену ER стресову загибель клітин. Клітини попередньо обробляли флувоксаміном протягом 30 хв та аналізували індуковану ER-стрес (тунікаміцин) загибель клітин. Лікування лише флувоксаміном не впливало на загибель клітин (рис. 2). Однак флувоксамін дозозалежнено послаблює ER, спричинену стресом, загибель клітин (рис. 2). Ці результати свідчать про те, що флувоксамін може послабити стрес ER.

Рисунок 1. Специфічний індуктор стресу ER, тунікаміцин, викликана експресія GRP78 та розщеплення PARP. Клітини SH-SY5Y стимулювали тунікаміцином (Tm: 0,5 мкг/мл) протягом 24 годин. Рівні експресії GRP78 та розщеплення PARP аналізували вестерн-блот.

Рисунок 2. Флувоксамін послаблює ER, спричинену стресом, загибель клітин. Клітини SH-SY5Y попередньо інкубували з флувоксаміном (FVX: 0,1 мкМ, 0,3 мкМ) протягом 1 год, а потім стимулювали тунікаміцином (Тм: 0,5 мкг/мл) протягом 36 год. Активність ЛДГ вимірювали як показник цитотоксичності. *P Ключові слова: лептин, флувоксамін, ендоплазматичний ретикулум-стрес, STAT3, ожиріння, депресія

Цитування: Hosoi T, Miyahara T, Kayano T, Yokoyama S та Ozawa K (2012) Флувоксамін, ослаблений ендоплазматичним ретикулумом, спричинений стресовою стійкістю до лептину. Спереду. Ендокрин. 3: 12. doi: 10.3389/fendo.2012.00012

Отримано: 16 квітня 2011 р .; Прийнято: 12 січня 2012 року;
Опубліковано в Інтернеті: 30 січня 2012 р.

Артур Донні Стросберг, Дослідницька організація Скриппса, США

Дунхай Ву, Гуанчжоуський інститут біомедицини та здоров’я, Китай
Тімо Дірк Мюллер, Університет Цинциннаті, Інститут метаболічних захворювань, США