Межі в мікробіології

Мікробні симбіози

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Ризик дієтичних шкідливих речовин та вплив на мікробіоти людини: можлива роль у кількох фенотипах дисбіозу Переглянути всі 7 статей

Редаговано
Маргарита Агілера

Університет Гранади, Іспанія

Переглянуто
Емілі В'єннуа

INSERM U1149 Центр вивчення запалення, Франція

Алекс Родрігес-Паласіос

Медичний факультет, Університет Кейс Вестерн Резерв, США

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

мікробіота

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Тяньцзіньська ключова лабораторія радіаційної медицини та молекулярної ядерної медицини, Інститут радіаційної медицини, Китайська академія медичних наук та Медичний коледж Пекінського союзу, Тяньцзінь, Китай
  • 2 Кафедра екстреної медицини, Університетська лікарня Норт-Шор, Манхасет, Нью-Йорк, США
  • 3 Лабораторія екстреної медицини, Інститут медичних досліджень імені Фейнштейна, Манхасет, Нью-Йорк, США

Вступ

Рак малого таза та черевної порожнини є загальними злоякісними захворюваннями, що впливають на шлунково-кишкові (ШКТ), сечостатеві та гінекологічні функції (Pal et al., 2019). Через великі розміри та легкість поширення на інші органи черевної порожнини та лімфатичну систему рак тазу та черевної порожнини все частіше регулярно лікується за допомогою променевої терапії (Liauw et al., 2013; Citrin, 2017). Після променевої терапії багато пацієнтів з раком малого тазу та черевної порожнини страждають на синдроми ШКТ (ГІС) (Peterson et al., 2010; Hauer-Jensen et al., 2014), такі як мальабсорбція, бактеріальний ентерит та діарея, які негативно впливають на лікування та можуть навіть призвести до смерті. Ці гострі та хронічні ускладнення стали серйозними проблемами для онкологів та медичних фізиків. Тому терміново необхідне виявлення потенційних факторів ризику, які можуть негативно вплинути на прогноз онкологічних хворих після променевої терапії, та розробка нових терапевтичних підходів.

Емульгатори - це клас молекул, подібних до миючих засобів, які зазвичай додають до оброблених харчових продуктів, фармацевтичних препаратів та косметики. До часто вживаних дієтичних емульгаторів належать Твін, Спан, стеариллактат натрію (SSL) та складні ефіри пропіленгліколю жирних кислот. Наприклад, Tween 80 (або полісорбат-80, P80) - це широко використовувана харчова добавка, яка надає гладку і стабільну консистенцію тортам, шоколаду, морозиву та іншим закусковим закускам. Крім того, P80 також використовується як диспергуючий засіб, солюбілізатор та стабілізатор для нерозчинних лікарських препаратів (наприклад, ін'єкції етопозиду та доцетакселу) для терапії раку (Iusuf et al., 2015; Al-Ali et al., 2018). Через потенційну токсичність та канцерогенність Р80 застосовували в обмежених дозах (до 1,0%) (Комісія з безпеки харчових продуктів [Японія], 2007; Робертс та ін., 2013). Однак зростання споживання Р80 за останні півстоліття пов'язане зі збільшенням частоти різних хронічних запальних та метаболічних захворювань (Chassaing et al., 2015), особливо в поєднанні зі змінами складу та транслокацією кишкової мікробіоти ( Робертс та ін., 2010). Як не дивно, хворим на рак під час променевої терапії давали б їжу та ліки, що містять Р80. Отже, чи споживає Р80 негативно погіршує ефективність променевої терапії, залишається недостатньо зрозумілим.

Шлунково-кишковий тракт населений спільнотою з трильйонів мікробів, яких спільно називають мікробіотою кишечника (Gopalakrishnan et al., 2018). Мікробіота кишечника забезпечує вирішальну користь для господарів, включаючи полегшення перетравлення їжі та розвиток метаболічної та імунної систем (Holmes et al., 2012; Wrzosek et al., 2013). Тим часом, збурення або транслокація кишкових мікробів може також призвести до низки патологічних процесів (Clemente et al., 2012; Lichtman et al., 2016), таких як хронічний коліт (Gevers et al., 2014), Clostridium difficile-асоційована хвороба (Ghose, 2013; Peng et al., 2018) та хвороба Крона (Mottawea et al., 2016). Порушення мікробіоти кишечника також супроводжуються низкою психічних захворювань та системних метаболічних захворювань, таких як тривога (Heijtz et al., 2011), зараження вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ) (Sun et al., 2016) та неалкогольні жирова хвороба печінки (Chu et al., 2019). Дійсно, суттєві факти свідчать про позитивну зв'язок між променевою терапією та розвитком коліту (Kirsch et al., 2010; Andreyev et al., 2013), а також про значні зміни складу мікробіоти кишечника після радіотерапії (Cui et al., 2016, 2017а).

У цьому дослідженні ми мали на меті визначити, чи призводить споживання P80 до шкідливих змін мікробіоти кишечника та посилює радіаційно-індуковану травму кишечника (RIII). Наші спостереження продемонстрували, що споживання Р80 змінило склад мікробіоти кишечника та погіршило індуковану радіацією токсичність ШКТ. Важливо, що введення бутирату перорально пом’якшило шкідливий вплив Р80 на опромінених тварин. У сукупності наші результати виявили, що Р80 є фактором ризику для онкологічних хворих під час променевої терапії, і вказали, що бутират може застосовуватися як терапевтичний варіант для захисту від радіаційно-асоційованої токсичності шлунково-кишкового тракту в доклінічних умовах.

Матеріали і методи

Тварини

Цей експеримент тестував групи (12 мишей на групу) самців мишей C57BL/6J віком 6–8 тижнів, яких утримували з використанням індивідуальної вентиляційної клітини як шість мишей на клітку, щоб забезпечити потужність дослідження 80%. Експериментальних мишей обробляли 200 мкл P80 (1,0% у стерильній воді), що вводили перорально протягом 7 днів, стерильну воду використовували як контроль. Спеціальне обладнання не використовувалось. Циклічні упередження контролювались наступним чином. Мишей випадковим чином розподіляли по лікувальних групах, не більше шести мишей на клітку, щоб забезпечити активну площу кожної миші не менше 0,01 м 2. Мишей утримували на чистих субстратах тирси і годували автоклавом (60 хв вологого циклу) гранульованої їжі (Cat # 1022, HFK Bioscience, Пекін, Китай, ≤5% CHO, ≥18% PRO, ≥4% FAT/кг) та автоклавували відфільтрована вода (рН близько 5) ad libitum. Щоб запобігти забрудненню постільної білизни, матеріал постільної білизни міняли кожні 2 дні, а мишей в тій самій когорті змішували та повторно розділяли кожні 2 дні протягом усіх експериментів, щоб уникнути впливу копрофагії на мікробіом кишечника. Їжу/воду замінювали кожні 4 дні. Перед початком усіх експериментів був використаний протокол спільного розміщення. Свіжий мишачий кал збирали регулярно вранці на наступний день після заміни клітки і зберігали близько 30 днів при -80 ° C до аналізу.

Введення полісорбату-80 (P80)

P80 був придбаний у Sigma (Іспанія, Cat # 59924). У цьому дослідженні споживання P80 проводили шляхом перорального введення 200 мкл протягом 7 днів (концентрація P80, 1,0% у стерильній воді) мишам перед опроміненням живота та тривали до кінця експерименту. Цю саму воду використовували як транспортний засіб для групи, обробленої водою (контроль).

Модель радіаційно-кишкової травми

Для всіх експериментів був використаний екскактор Gammacell ® 40 (Атомна енергія Канади, Лім, Канада). Самців (приблизно 20 г ваги тіла) мишей обробляли одноразовою дозою 12 Гр або 15 Гр γ-променя зі швидкістю 1,0 Гр/хв (тест за допомогою вимірювача потужності дози, проведений Exactor), загальне опромінення живота (TAI) за допомогою специфічної сталевої камери, а доза опромінення контролювалася за допомогою вимірювача потужності дози. Після опромінення мишей повертали в приміщення для тварин для щоденного спостереження та обробки, як описано вище. Мишей усіх груп спостерігали за станом виживання протягом 30-денного курсу експерименту, а потім жертвували для збору зразків тканин для загального структурного та функціонального обстеження.

Фарбування гематоксиліном та еозином (ВІН)

Після евтаназії тонкий кишечник і товста кишка мишей фіксувались у 4% забуференному формаліні протягом ночі при кімнатній температурі, а потім вбудовувались у парафін. Тканини розрізали на товщину 5 мкм і занурювали в гематоксилін та еозин (Solarbio, Китай) із застосуванням стандартних протоколів.

Періодичне фарбування кислотою-Шиффом (PAS)

Тканини тонкої кишки фіксували протягом ночі в розчині Carnoy (60% сухого етанолу, 30% хлороформу, 10% крижаної оцтової кислоти) (Jiangtian Chemical Technology, Китай), а парафінові зрізи 5 мкм депарафінізували та окислювали в 1% періодичній кислоті (Solarbio, Китай) протягом 10 хв, після промивання тканини інкубували в реактиві Шиффа (Соларбіо, Китай) протягом 10 хв, промивали теплою водою та фарбували гематоксиліном (Соларбіо, Китай) протягом 30 с, промивали та зневоднювали перед монтажем.

Аналіз калових мікробіоти

Для цього дослідження зразки стільця були зібрані у п’яти мишей у різних клітках, як описано раніше (Cui et al., 2017b), а потім зберігались при -80 ° C до використання. ДНК витягували із зразків калу за допомогою набору для ізоляції ДНК Power fecal ® (MoBio, Карлсбад, Каліфорнія, США). ДНК відновлювали за допомогою 30 мкл буфера в наборі. Ампліфікацію та секвенування гена V4 для рибосомної РНК (rRNA) 16S проводили за технологією Illumina MiSeq. Бібліотека була послідовно розподілена на Illumina HiSeq 2500 і створено парне читання на 250 bp. Аналіз послідовності проводився за допомогою програмного забезпечення Uparse (Uparse v7.0.1001 1). Послідовності із ≥97% подібності були призначені тим самим OTU. Репрезентативна послідовність для кожного OTU була перевірена для подальших анотацій. Для кожної репрезентативної послідовності базу даних Silva123 використовували на основі алгоритму класифікатора RDP (версія 2.2 2) для анотації таксономічної інформації. Статистичну різницю високопродуктивного секвенування 16S рРНК оцінювали за допомогою HSD Тукі. Праймери наведені в додатковій таблиці S1.

Адміністрація бутирату

У мишей групи, які отримували бутират, бутират натрію (Токіо Хімічна промисловість, Японія) проводили щодня протягом 10 днів поспіль після 12 Гр TAI. Свіжий кал збирали до та після 7 днів обробки Р80, а також 7 днів після бутирату, для подальшого аналізу.

Введення антибіотичного коктейлю (ABX)

ABX складався з ципрофлоксацину (0,125 г/л), метронідазолу (0,1 г/л), ванкоміцину (0,05 г/л), стрептоміцину (100 од/л) та пеніциліну (100 од/л). Мишей піддавали впливу ABX у питній воді після TAI. Цю саму воду використовували для групи, обробленої водою (TAI + P80).

Вимірювання жирних кислот із коротким ланцюгом

Кількісне визначення коротколанцюгових жирних кислот проводили за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) (Thermo Fisher, США) у супернатантах зразків калу, відновлених у PBS. Коротше кажучи, 1 мл фекального розчину підкислюють 1/10 об'ємом H2SO4 (0,01 М) і пропускають через конденсатор для виділення летких сполук у зразку. Після фільтрації через мембрану 0,45 мкм рівний об'єм зразків завантажували на хроматографічну колонку ВЕРХ: C18 AQ (4,6 * 250 мм), сірчану кислоту (0,01 М) використовували як рухому фазу, а рівень SCFA визначали за допомогою зовнішнього стандартний метод калібрування.

Трансплантація калової мікробіоти (FMT)

Для експериментів FMT свіжі матеріали для трансплантації готували в той же день трансплантації протягом 4 годин до перфузії шлунка, щоб запобігти змінам у складі бактерій (Cui et al., 2017b). Зокрема, 200 мг випорожнень мишей, оброблених Р80, ресуспендували у 2 мл стерильного фізіологічного розчину, перемішували на вортексі протягом 30 с і залишали стояти протягом 30 хв анаеробно. Вісім тижнів-самців мишей-реципієнтів C57BL/6J отримували перорально щодня із супернатантом протягом 10 днів до 12 Гр TAI і підтримували на стерильній воді протягом усього експерименту.

Кількісна ланцюгова реакція полімерази в реальному часі (qRT-PCR)

Загальну РНК відокремлювали від тканин або клітин за допомогою Trizol (Invitrogen, США) відповідно до протоколу виробника. кДНК синтезували із загальної РНК з використанням полі (А) - хвостої загальної РНК та праймера зворотної транскрипції за допомогою зворотної транскриптази ImPro-II (Promega, США), згідно з протоколом виробника. RT-PCR проводили за допомогою DreamTaq TM Hot Start Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Каліфорнія, США) згідно з протоколом виробника. QRT-PCR проводили згідно з інструкціями Fast Start Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche Diagnostics GmbH, Німеччина). GAPDH використовували як ген ведення домашнього господарства. Експресія гена була позначена за допомогою 2 –ΔΔCt і нормалізована до GAPDH. Зокрема, розрахований 2 –ΔΔCt у контрольній групі був встановлений як 1, експресія гена в експериментальній групі оцінювалася як 2 –ΔΔCt (експериментальна група)/2 –ΔΔCt (контрольна група). Праймери, використані в цьому дослідженні, були перелічені в додатковій таблиці S2.

Залишкові вимірювання P80

Кількісне визначення залишкового Р80 проводили методом ВЕРХ у супернатантах зразків калу. Хроматографічний аналіз проводили на Dionex Ultimate 3000 (Dionex, США), і мобільна фаза складалася з 20 мМ ацетату амонію та ацетонітрилу (9: 1). Після фільтрування через мембрану 0,45 мкм рівний об'єм зразків завантажували на ВЕРХ. Швидкість потоку становила 0,6 мл/хв, а температура колонки становила 30 ° С.

Імуногістохімічне фарбування (IHC)

Після евтаназії товсту кишку мишей фіксували на ніч при фіксації карнозу при кімнатній температурі, а потім закладали у парафін. Тканини розрізали на товщину 5 мкм і блокували 5% BSA (Solarbio, Китай) протягом 1 години при кімнатній температурі, а потім інкубували з первинними антитілами протягом ночі при 4 ° C та інкубували з кон’югованим козом проти кролика флуоресцеїн ізотіоціанатом (FITC). Антитіло IgG (ZSGB Bio, Китай) протягом 1 год при кімнатній температурі, потім фарбують набором для фарбування DAB (ZSGB Bio, Китай) з подальшим контрастуванням ядерним гематоксиліном. Використовували первинне антитіло кролика проти MUC2 (Abcam, США).

Кількісне визначення фекальних LCN2 та IL-10

Заморожені зразки фекалій ресуспендували в PBS, що містить 0,1% Твін 20 (Jiangtian Chemical Technology, Китай), до кінцевої концентрації 0,1 г/мл, потім перемішували на вихрі для отримання однорідної фекальної суспензії з наступним центрифугуванням протягом 10 хв при 14000 × g і 4 ° C. Рівні LCN2 та IL-10 вимірювали з прозорого супернатанту за допомогою набору ELISA для мишачого ліпокаліну (LCN2) (Solarbio, Китай) або набору ELISA для мишачого IL-10 (Solarbio, Китай) відповідно до протоколу виробника. Зчитайте значення OD 450 нм за допомогою зчитувача мікропланшетів (Rayto, Китай). Зокрема, з величиною поглинання OD як ординатою (Y) та концентрацією стандартного LCN2 (або IL-10), що вимірюється як абсциса (X), робиться відповідна крива. Вміст LCN2 (або IL-10), що вимірюється у зразку, може бути перетворений із стандартної кривої у відповідну концентрацію відповідно до його значення OD.

Культура клітин

Клітинну лінію ентероцитів людини HIEC-6 культивували в середовищі RPMI-1640 (Gibco, Каліфорнія, США) з додаванням 10% фетальної бромідної сироватки (FBS) (Gibco, CA, США) при 37 ° C у 100% зволоженому атмосфера 5% СО2.

Трансфекція клітин

Для трансфекції клітин клітини культивували в 6-лунковому планшеті протягом 24 годин, а потім трансфікували siРНК. Всі трансфекції проводили з використанням поліефіриміду (PEI) (Sigma, Іспанія) згідно з протоколом виробника. si-GPR43 був синтезований компанією RiboBio (Гуанчжоу, Китай). Послідовності siРНК були перераховані в додатковій таблиці S3.

Статистичний аналіз

Кожен експеримент повторювали принаймні три рази. Значимість оцінювали шляхом порівняння середніх значень (6 стандартних відхилень; SD) за допомогою Стьюдента т-тест між кожною двома когортами таким чином: *стор # стор Ключові слова: емульгатор, променева ентеропатія, кишкова мікробіота, метаболіт мікробіоти кишечника, GPR43

Цитування: Li Y, Xiao H, Dong J, Luo D, Wang H, Zhang S, Zhu T, Zhu C, Cui M і Fan S (2020) Метаболіт кишкової мікробіоти бореться з дієтичним полісорбатом 80-сильного радіаційного ентериту. Спереду. Мікробіол. 11: 1450. doi: 10.3389/fmicb.2020.01450

Отримано: 19 грудня 2019 р .; Прийнято: 04 червня 2020 р .;
Опубліковано: 26 червня 2020 р.

Маргарита Агілера, Університет Гранади, Іспанія

Емілі Вієннюа, INSERM U1149 Center de Recherche sur l’Inflammation, Франція
Олександр Родрігес-Паласіос, Університет Кейс Вестерн Резерв, США

† Ці автори зробили однаковий внесок у цю роботу