Електроакупунктура в Гуаньюані (CV 4), Зусанлі (ST 36) та Байхуї (DU 20) регулює зміни, пов’язані зі старінням профілю експресії генів гіпокампу у підгостро старіючих щурів.

Цзяньмін Лю

1 Акупунктурно-моксибусійний та ортопедичний коледж, Хубейський університет китайської медицини, Ухань, Китай

2 Спільний інноваційний центр провінції Хубей з профілактичного лікування голковколюванням та приживленням, Ухань, Китай

Цзін Лю

Гуан’ань Ван

3 Третій коледж клінічної медицини, Університет китайської медицини Хенань, Чженчжоу, Китай

Гуанья Лю

1 Акупунктурно-моксибусійний та ортопедичний коледж, Університет китайської медицини Хубей, Ухань, Китай

Хуаньцзяо Чжоу

Юнь Фан

Fengxia Liang

Хуа Ван

Пов’язані дані

Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Анотація

Вступ

Матеріали і методи

Лікування тварин

Тридцять щурів-самців SD у 3-місячного віку були отримані з Експериментального центру з тваринами Медичного університету Хебея, Китай [Номер ліцензії на експериментальне тваринництво: SCXK (Хебей) 2008-1-003]. Усі щури вирощувались в індивідуально провітрюваних клітках з температурою від 20 ° C до 25 ° C. Вологість становила від 45% до 55%. Світло забезпечували з 8 ранку до 8 вечора для імітації добових ритмів, в той час як їжу та воду пропонували в достатній мірі. Всі методи лікування тварин були схвалені Комітетом з етики тварин Університету китайської медицини Хубей, № [2016] IEC (010).

Через 1 тиждень адаптації щурів випадковим чином розділили на три групи, як описано нижче: контрольну групу (С), модельну групу підгострого старіння (М) та групу електроакупунктури (М + ЕА), по 10 щурів для кожної групи. Щурів у групі С вирощували зазвичай без будь-яких обробок. У той час як модельних щурів з підгострим старінням отримували D-галактозою s.c. ін’єкція безперервно протягом 40 днів з другого тижня. Концентрація D-галактози s.c. становив 350 мг.кг-1.d-1, один раз на кожен день [29]. Після моделювання щурів у групі М вирощували без будь-яких обробок. Тоді як група Щурів М + ЕА розпочала лікування ЕА в Гуаньюані (CV 4), Зусанлі (ST 36) та Байхуї (DU 20) один раз на день після моделювання протягом 27 днів (процедури показані наступним чином). Процес експерименту був показаний на рис. S1. Температуру тіла, температуру язика та вагу щурів у різних групах вимірювали кожні три дні під час виготовлення моделей та процедур електроакупунктури, щоб переконатись, що фізіологічні показники щурів є нормальними. Всі зусилля були зроблені, щоб мінімізувати страждання.

Лікування електроакупунктурою (ЕА)

Стерильні голки для акупунктури [розмір: φ0,30 * 25 мм (діаметр: 0,30 міліметра, довжина: 25 міліметрів); виробництва компанії Suzhou Acupuncture & Moxibustion Appliance Co., Lid, Suzhou, P.R. China] та генератор імпульсів (6805-II, Shanghai Taicheng Technology Development Co., LTD) використовувались під час лікування ЕА. Голки вводили перпендикулярно в м’язовий шар на Гуанюань (CV 4), Зусанлі (ST 36) і вводили горизонтально в підгалеальну тканину в точці Байхуй (DU 20) на глибину 2 мм. Точка Гуанюаня (CV 4) була підключена до негативного заряду генератора імпульсів, а зусанлі (двосторонні зусанлі використовувались по черзі при обробці ЕА) - до позитивного заряду (безперервна хвиля: 2 Гц, 1 мА, тривала 15 хв). Baihui (DU 20) стимулювали голками одночасно: Після того, як голка досягла потрібного місця, крутити та обертати голку назад і вперед безперервно з частотою 2–3 рази в секунду протягом 30 секунд. Таку саму маніпуляцію робили через кожні 5 хвилин протягом трьох разів до виведення голки. Лікування ЕА проводили щодня, крім неділі, і тривало 27 днів. Цей протокол лікування електроакупунктурою (ЕА) був поміщений у протоколи .io. Посилання на цифровий ідентифікатор об’єкта (DOI): http://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.ky8cxzw.

Відбір проб тканин

В кінці лікування ЕА щури з трьох груп голодували протягом ночі. Потім усіх щурів вбивали вивихом шийного хребця, а мозок швидко висікали після внутрішньочеревної анестезії з використанням пентобарбітального натрію. Зібрані зразки промивали холодним фізіологічним розчином. Згодом ділянку гіпокампу розділили, заморозили в рідкому азоті і потім витримали при -80 ° C для вилучення РНК. Площа гіпокампу з десяти щурів у кожній групі становить одну пробу, а потім три зразки з групи С, групи М та групи М + ЕА були підготовлені для вилучення РНК.

Підготовка РНК та кількісна ПЛР у реальному часі (q-PCR)

RNAiso Plus (TaKaRa Biotech. Co., Далянь, Китай) використовували для вилучення загальної РНК згідно з протоколом виробника. Всі зразки РНК обробляли ДНКазою I (TaKaRa Biotech. Co., Далянь, Китай) і заморожували при -80 ° C перед експериментом з мікрочипами ДНК. Кількість та чистоту РНК оцінювали за допомогою NanoDrop ND-1000 (Критерії проходження для коефіцієнтів поглинання встановлені при A260/A280 ≥ 1,8 та A260/A230 ≥ 1,6). Значення RIN визначаються за допомогою аналізу Agilent RNA 6000 Nano для визначення цілісності РНК (Критерій проходження значення RIN встановлюється при ≥ 7, що вказує на прийнятну цілісність РНК). Забруднення гДНК оцінювали за допомогою гель-електрофорезу.

КДНК із першої ланцюга була підготовлена набором синтетичних кДНК із першої ланцюга (Genecopoeia, Гуанчжоу, Китай) відповідно до протоколу виробника. Потім для проведення qRT-PCR була використана система q-PCR BIO-RAD CFX96 (виявлення флуоресцентного барвника SYBR Green I). Рівень мРНК нормалізували за допомогою гена домашнього господарства β-актину, а рівні відносної експресії обчислювали методом 2-ΔΔCt [30].