Дуоденальний лептин стимулює секрецію холецистокініну

Свідчення позитивної петлі зворотного зв'язку лептину-холецистокініну

Сандра Гійо,
Маріон Буйс,
Аннік Цокас,
Жан П'єр Леньо і
Андре Бадо

Від Національного інституту сантету та дослідницького медікалу (INSERM) Unité 410, Факультет медицини Ксав'є Біша, Париж, Франція

Зверніться до листування та запитів на передрук до Андре Бадо, INSERM Unité 410, Faculté de Médecine Xavier Bichat, 16, rue Henri Huchard, 75018 Париж, Франція. Електронна пошта: badobichat.inserm.fr .

Свідчення позитивної петлі зворотного зв'язку лептину-холецистокініну

Анотація

CCK, холецистокінін
ERK, кіноза, пов’язана з позаклітинним сигналом
ERK-P, фосфо-ERK
INSERM, Національний інститут Сантезу та науково-дослідної медицини
ІЧ, імунореактивний
MAPK, мітоген-активована протеїнкіназа
MEK, MAPK кіназа
PI3-K, фосфоїнозитид 3-кіназа
RIA, радіоімуноаналіз
СТАТ, перетворювачі сигналів та активатори транскрипції.

Спочатку повідомлялося, що лептин, продукт гена ob, виробляється жировими клітинами (1). Він виділяється в кров і транспортується через гематоенцефалічний бар’єр у гіпоталамус, де активує специфічні рецептори лептину (2,3) та регулює енергетичний гомеостаз, змінюючи споживання та витрачання енергії (4–6). Лептин регулює споживання їжі за допомогою механізмів, що включають перехресні розмови між рецепторами лептину гіпоталамусу та різними нейропептидами, що беруть участь у контролі годування. Рецептор лептину (Ob-R) є членом сімейства gp130 цитокінових рецепторів. Це відбувається в декількох ізоформах, що є результатом альтернативного сплайсингу гена рецептора db лептину (2,3). В даний час вважається, що довга ізоформа, Ob-Rb, може активувати перетворювачі сигналу та активатори шляхів транскрипції (STAT), тоді як і Ob-Rb, і коротка ізоформа (Ob-Ra) можуть перетворювати сигнали через субстрати рецепторів інсуліну та через шляхи мітоген-активованої протеїнкінази (MAPK) (7).

Сигнали, що виникають із верхніх відділів шлунково-кишкового тракту при годуванні, передаються в мозок блукаючим нервом. Ці сигнали є ключовими компонентами контролю насичення, спричиненого їжею. Холецистокінін (CCK) секретується з ендокринних I клітин дванадцятипалої кишки і зазвичай функціонує як один із цих короткочасних сигналів ситості (8,9). Цікаво, що спричинене лептином пригнічення прийому їжі (10) та стимуляція екзокринних секрецій підшлункової залози (11) можуть блокуватися антагоністом рецептора CCK-1. Ці дані дозволяють припустити, що ендогенний CCK бере участь у цих ефектах, діючи через рецептори CCK-1. Однак наразі невідомо, чи лептин безпосередньо модулює вивільнення CCK.

Лептин також виробляється шлунком (12–14) і в основному виділяється в шлунковий сік після CCK у щурів (12,15) та після стимуляції секретину або вагуса у людей (14,16). Частина шлункового лептину не повністю руйнується внаслідок протеолізу, що вказує на те, що він потрапляє в кишечник в активній формі і, отже, може ініціювати біологічні процеси, що контролюють функції кишкового тракту. Справді, просвітній лептин підвищує активність протоннозалежного транспортера, що межує з кистю, PepT1, що посилює кишкову абсорбцію олігопептидів (17). Це підвищує ймовірність того, що лептин також може модулювати секреторну активність ендокринних клітин кишечника за умови, що лептин присутній у кишковому соку.

У цьому дослідженні ми вивчали ефекти in vitro рекомбінантного лептину на вивільнення CCK та досліджували внутрішньоклітинні механізми дії лептину в клітинах STC-1, що секретують CCK. Ми припустили, що лептин, який досягає дванадцятипалої кишки, здатний модулювати вивільнення CCK. Для перевірки цієї гіпотези ми визначили, чи присутній лептин у дуоденальному соку, а потім дослідили ефект in vivo прямої дуоденальної доставки лептину на концентрацію CCK у плазмі крові на моделі, що перфузує дванадцятипалу кишку. Ми поставили під сумнів фізіологічну значимість даних, проаналізувавши in vivo кінетичні закономірності концентрації CCK та інсуліну в плазмі крові та аналізуючи вміст лептину в шлунку після прийому їжі у щурів Цукера. Нарешті, ми дослідили ефекти in vivo антагоністів рецепторів CCK на зміни цих параметрів, спричинені годуванням.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Культура клітин.

Клітини STC-1 (подарунок від д-ра Дж. Абелло, Національного інституту імені Сантету та університету досліджень медицини [INSERM] U-45, Ліон, Франція) походять від клітинних ліній ендокринної пухлини кишки, розроблених на мишах, що експресують трансген для промотору інсуліну щурів, зв’язаного з вірусом мавпи 40 великим антигеном Т та антигеном малого t вірусу поліоми (18). Клітини STC-1 між пасажами 15 і 35 вирощували в RPMI-1640 плюс глутамін (Sigma, St Louis, MO), доповнений 5% фетальною бичачою сироваткою, 100 одиниць/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) у зволоженій атмосфері, що містить 95% O2 та 5% CO2 при 37 ° C.

RT-PCR аналіз рецепторів лептину.

Загальну РНК екстрагували з клітин STC-1 реагентом Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Коротко кажучи, кДНК першої нитки синтезували із загальної РНК 2 мкг і реверсували транскрипцію за допомогою 200 одиниць зворотної транскриптази за допомогою набору Superscript II (Invitrogen) відповідно до рекомендацій виробника. Наступні олігонуклеотидні праймери були синтезовані Sigma Genosys (Кембриджшир, Великобританія): прямий праймер для Ob-Rb був 5′-ATGAAGTGGCTTAGAATCCCTTCG-3 ′, а зворотний праймер 5′-ATATCACTGATTCTGCATCCTG-3 ′. Праймери, що використовувались для гена β-актину, були наступними: 5′-CGAGAAGATGACCCAGATCATG-3 ′ і зворотний 5′-AGTGATCTCCTTCTGCATCCTG-3 ′. Зразки денатурували нагріванням при 95 ° С протягом 3 хв. Потім ПЛР проводили в умовах, описаних раніше (14). Продукти ПЛР відокремлювали електрофорезом у 2% агарозному гелі. Гель фарбували бромідом етидію і розглядали під ультрафіолетовим освітленням. Очікувані розміри продуктів ПЛР становили 375 п.н. для Ob-Rb та 606 п.н. для β-актину.

Вестерн-блот-аналіз.

Для загальної екстракції білка гранули клітин STC-1 гомогенізували при 4 ° C у буфері для лізису, доповненому 0,1 мг/мл фенілметилсульфонілфториду, 100 мкмоль/л апротиніну та 100 ммоль/л NaVO4. Гомогенати центрифугували при 15000g протягом 30 хв при 4 ° C, і супернатанти збирали для вестерн-блот-аналізу. Кількісну концентрацію білка визначали за допомогою аналізу білка Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія).

Коротко, солюбілізовані білки розщеплювались електрофорезом на 7,5% гелях SDS-PAGE. Розділені білки переносили на нітроцелюлозні мембрани та піддавали імуноблот-аналізу за допомогою поліклональної анти-сироватки Ob-Rb, вирощеної у кроликів, проти СООН-кінцевого пептиду рецептора лептину (амінокислоти 890–903), специфічного для ізоформи Ob-Rb (OBR 12 -A; Biotrend Chemikalien, Кельн, Німеччина), розведений 1: 750. Після 1-годинної інкубації мембран з кон'югованим антитілом, пероксидазою пероксидази хрону (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), розведеним 1: 1000, імунні комплекси виявляли посиленою хемілюмінесценцією (Pierce, Rockford, IL).

Імуноцитохімія.

Клітини STC-1 висівали на 4-лункові скляні предметні стекла Lab-Tek II (Nalge Nunc International, Naperville, IL). Через 2 дні інкубації при 37 ° C з 95% O2: 5% CO2 середовище видаляли і клітини двічі промивали холодним PBS. Потім ми додали фіксатор формаліну (4% параформальдегіду) та інкубували клітини протягом 10 хв. Потім клітини перетравлювали 0,1% пепсину в 0,01 н. HCl, рН 2,25, протягом 10 хв для отримання антигену. Перед імунореакцією активність ендогенної пероксидази видаляли додаванням 0,3% H2O2 та інкубацією протягом 5 хв. Клітини інкубували протягом ночі при 4 ° C з кролячою поліклональною анти-сироваткою Ob-Rb (OBR 12-A) або поліклональною анти-сироваткою Ob-R (TP283), вирощеною у кроликів проти NH2-кінцевого пептиду рецептора лептину (амінокислоти 25–208 ) (Clinisciences, Монруж, Франція) або з кролячим антитілом до CCK8 (Sigma), кожне з яких розбавляли 1: 100. Потім предметні склянки інкубували 1 годину при кімнатній температурі з антитілом до кролика до свині, а потім із кролячим пероксидазно-антипероксидазним комплексом Z0113 (Dako, Carpinteria, CA), кожен розведений 1: 100. Імуногістохімічне фарбування проводили з використанням 3 ′, 3′-діамінобензидину гідрохлориду в якості пероксидазного хромогену (Sigma).

Елементи управління.

У клітинах STC-1 не спостерігалося імунозабарвлення при наступних умовах: 1) нормальна сироватка кролика, що використовується замість імунної сироватки кролика, та 2) попередня інкубація антисироватки Ob-Rb (OBR 12-A) з контрольним пептидом 20 мкг (OBR 12-P) на мілілітр розведеної антисироватки протягом 3-4 годин при кімнатній температурі.

Фосфорилювання позаклітинної сигнальної кінази (ERK).

Протягом ночі сироваткові культури клітин STC-1 спочатку інкубували протягом 30 хв при 37 ° C з носієм, з 10 мкмоль/л PD98059 (селективний інгібітор активності MAPK-кінази [MEK]), або з 1-10 мкмоль/л вортманін (інгібітор фосфоїнозитид 3-кінази [PI3-K]). Потім до клітин додавали носій (контроль) лептину миші 100 нмоль/л (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота) або бомбезин (Sigma) і додатково інкубували протягом 1 години. Зразки розчиненого екстракту білка (80 мкг) розчиняли електрофорезом на 12,5% гелях SDS-PAGE, як описано. Плямки досліджували протягом ночі при 4 ° C за допомогою кролячих поліклональних антитіл: анти-ERK-1/2 MAPK (pTpY185/187) фосфоспецифічних (Biosource Europe, Nivelles, Бельгія), розведених 1: 1000. Потім ті самі мембрани видаляли та імуноблотували антисироваткою ERK-1 (Santa Cruz Biotechnology), розведеною 1: 500, для визначення загальної кількості білків MAPK. Імунні комплекси були виявлені посиленою хемілюмінесценцією (Пірс). Імуноблоти кількісно визначали за допомогою аналізу зображень NIH (Scion Corporation), і результати виражали як відношення фосфо-ERK (ERK-P) до загальної ERK.

Секреторні дослідження CCK in vitro.

Клітини STC-1 висівали на 12-лункові культуральні планшети (5 × 104 клітини/лунку). Коли клітини досягли 80% злиття, середовище видаляли і одношарові культури клітин STC-1 двічі промивали PBS. Потім до клітин додавали живильне середовище, доповнене мишачим лептином або бомбезином, та інкубували при 37 ° С у 95% СО2 протягом 1 години. Супернатанти збирали і заморожували при -20 ° C. Вміст клітин екстрагували 2 моль/л CH3COOH-20 ммоль/л HCl, обробляли ультразвуком, кип'ятили протягом 10 хв, доводили pH до 7 моль/л NH3 і заморожували при -20 ° C. CCK визначали у супернатантах та екстрактах клітин методом радіоімунологічного аналізу (RIA).

В іншому наборі експериментів клітини STC-1 попередньо інкубували протягом 30 хв при 37 ° C з 10 мкмоль/л PD98059, селективним інгібітором активності МЕК, або 10 мкмоль/л вортманіну, інгібітором PI3-K, перед додаванням транспортний засіб (контроль) або лептин. Через годину супернатанти були видалені та використані для визначення CCK RIA.

Тварини.

Самці щурів Wistar вагою 260–280 г та самці 6-тижневих ожирілих (fa/fa) та худорлявих (Fa/fa) щурів цукерів (Iffa Credo, Les Oncins, L'Arbresle, Франція) знаходились у клітках у стандартних лабораторних умовах з водопровідна вода та звичайна їжа, надані за бажанням, протягом 12-годинного/12-годинного циклу світло/темрява при температурі 21–23 ° C. Тварин обробляли відповідно до стандартів Європейського комітету щодо догляду та використання лабораторних тварин.

Визначення лептину в дуоденальному соку та ексклюзивна хроматографія.

Щурів, яких годували вільно від їжі, або щурів, яких позбавляли їжі протягом 24 годин, знеболювали, а відвідний катетер хірургічно імплантували на 1 см нижче зв’язки Трейца для збору дуоденального соку протягом 60 хв після внутрішньовенної (через стегнову вену) ін’єкції сольового розчину або 30 мкг/кг карбахолу (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі). Вимірювали рН і визначали лептин за допомогою RIA. Зразок дуоденального соку або мишачого лептину подавали на ексклюзивну хроматографію за допомогою колонки Superdex 200 (16/60) (Pharmacia Biotech, Фрайбург, Німеччина). Колонку врівноважували PBS, що містила 0,1% BSA та 0,01% азиду натрію при 4 ° C зі швидкістю потоку 2 мл/хв. Об’єм нанесеної проби становив 5 мл, а фракції 2 мл збирали і зберігали при -20 ° C до отримання RIA лептину. Колонку регулювали за допомогою комерційно доступних наборів для калібрування білків (Pharmacia Biotech).

Дуоденальна перфузія.

Дуоденальні перфузійні дослідження проводили на щурах, які були позбавлені їжі протягом 24 годин, при наявності води за бажанням. Щурів знеболювали етилуретаном (1,2 г/кг, внутрішньом’язово) (Prolabo, Париж, Франція), а після лапаротомії транпілоричну припливну канюлю вводили в дванадцятипалу кишку і вводили відвідну канюлю на 1 см нижче зв’язки Трейца. Дуоденальний сегмент перфузували зі швидкістю потоку 4 мл кожні 15 хв буфером Кребса-Рінгера, що складався з (у ммоль/л): 0,5 MgCl2, 4,5 KCl, 120 NaCl, 0,7 NaHPO4, 1,5 NaH2PO4, 1,2 CaCl2, 15 NaHCO3 та 10 глюкози, доведені до рН 7,5. Розчин витримували при температурі 37 ° C за допомогою водяної сорочки перед тим, як потрапити в дуоденальний сегмент. Після 15-хвилинного періоду стабілізації до перфузійного розчину додавали носій, що містив BSA як неспецифічний білок або мишачий лептин (1–100 нмоль/л). Зразки крові збирали через сонний катетер у пробірках, що містять ЕДТА, як описано раніше (11), і центрифугували при 10000 г протягом 3 хв. Плазму видаляли і швидкість VAC концентрували після екстракції етанолом і зберігали при -20 ° C до CCK RIA.

Вплив годування самостійно або у поєднанні з антагоністами рецептора CCK на рівень лептину в шлунку, інсуліну в плазмі крові та рівня CCK.

Самці щурів Вістар або Цукер звикли їсти пелетну дієту між 10:00 та 18:00. коли їжу вилучали до наступного ранку, але вода була доступна за бажанням.

У день експерименту, починаючи з ранку (10:00 ранку), тваринам дозволяли харчуватися зваженою стандартною лабораторною дієтою на гранулах протягом різних періодів часу. У кожен період їжі зважували і визначали споживання. Щурів знеболювали, кров відбирали з черевної аорти і центрифугували, а плазму видаляли і зберігали при -20 ° C до отримання АРВ CCK та інсуліну. (Набори RIA; Linco Research, Сент-Чарльз, Міссурі). Шлунок витягли і відкрили. Його вміст збирали та центрифугували, а супернатанти видаляли і зберігали при -20 ° C до аналізу на лептин у шлунковому соку за допомогою RIA. Слизову оболонку фундалу видаляли, зважували, гомогенізували та центрифугували 10000 г протягом 10 хв, як описано раніше. Супернатанти використовували для визначення лептину шлунку.

Для досліджень антагоністів, за 10 хв до прийому їжі, тваринам інтраперитонеально вводили носій (контроль) або 1 мг/кг L364718 (подарунок від професора Б. Рокеса, INSERM 266, Париж, Франція) або YM022 (подарунок від Яманучі Pharmaceutical, Tokyo), антагоністи рецепторів CCK-1 та CCK-2 відповідно у фізіологічному розчині, що містить 1% DMSO. Через 15 хв прийому їжі визначали інсулін у плазмі, CCK у плазмі, вміст лептину в шлунку та вивільнення лептину.

АРВ ЦКК.

CCK визначали згідно з процедурою, описаною Rehfeld (19). Коротко кажучи, COOH-кінцеве анти-CCK антитіло (подарунок професора Дж. Рехфельда, Копенгаген, Данія) інкубували при 4 ° C протягом 4 днів з CCK-8 (Sigma) або з пробами плазми та [125 I] CCK- 8 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) в буфері RIA, що складається з 20 ммоль/л барбітального буфера, 0,6 ммоль/л тіомерсалу та 0,11% BSA об/об (pH 8,4). Зв'язані та вільні фракції відокремлювали поглинанням вільного [125 I] CCK-8 на активний вугілля з покритим декстраном Т70 (4 та 40 г/л відповідно) у буфері RIA, що містить 10% відфільтрованої кінської сироватки. Радіоактивність у зв’язаній фракції вимірювали за допомогою гамма-лічильника. За цих умов межа виявлення становив 0,5 пг CCK.

Статистичний аналіз.

Результати виражаються як середні значення ± SE. Їх порівнювали за допомогою одностороннього аналізу ANOVA, а потім тесту множинних порівнянь Тукі-Крамера, якщо були отримані значні результати.

РЕЗУЛЬТАТИ

Клітини STC-1 експресують рецептори лептину.

RT-PCR та Вестерн-блот-аналіз використовувались для вивчення експресії рецепторів лептину в клітинах STC-1, що продукують CCK. Виявлено продукт на 375 п.о., що відповідає позиціям 2401–2776 Ob-Rb (рис. 1А). Після секвенування кДНК цей продукт виявився на 100% ідентичним транскрипту гена Ob-Rb миші.

Імуноблотування білкових екстрактів STC-1 антитілом проти Ob-Rb виявило дві імунореактивні (ІЧ) смуги з відносною молекулярною масою 130- і 170-кДа (рис. 1В). Визначена ІЧ-смуга 130 кДа відповідала довгій ізоформі рецептора лептину на основі передбачуваної молекулярної маси, а смуга 170 кДа, ймовірно, відповідала глікозильованій формі Ob-Rb. Імуноцитохімічні дослідження (рис. 1C і D) з використанням антитіла, яке розпізнає всі ізоформи рецепторів лептину, показали, що імунореактивність рецептора лептину дифузно розподілена в цитоплазмі з сильним фарбуванням на мембранах деяких клітин (рис. 1C). Використання антисироватки, специфічної для Ob-Rb, дало подібний розподіл рецепторів лептину в клітинах STC-1 (рис. 1D).

Лептин стимулює вивільнення CCK з клітин STC-1.

Імунозабарвлення клітин STC-1 специфічним антитілом проти CCK показало, що 90% клітин містять CCK (дані не наведені), що узгоджується з результатами попередніх досліджень (20). Середній вміст клітинного CCK становив 1308 ± 101,5 пмоль/л (n = 16), а базальний рівень вивільнення CCK за 1 год (24,9 ± 6,2 pmol/l, n = 16) становив 1,9% від загального вмісту CCK клітини.

В: Експресія рецепторів лептину на клітинах STC-1. Загальну РНК, вилучену з клітин STC-1, аналізували на Ob-Rb методом RT-PCR, як описано в дослідженні та методах дослідження. Електрофорез агарозного гелю продуктів ПЛР генерували за допомогою праймерів, специфічних для довгої ізоформи (Ob-Rb) гена рецептора лептину. Доріжка 1: маркерна ДНК драбина; смуга 2: клітини STC-1; смуга 3: негативний контроль, в якому зворотна транскриптаза була опущена; доріжка 4: β-актин. Очікувані розміри продуктів ПЛР становили 375 п.н. для Ob-Rb та 606 п.н. для β-актину (стрілки). B: Вестерн-блот-аналіз екстрактів клітин STC-1 у пасажі 15 (доріжка 1), 25 (доріжка 2) та 35 (смуга 3) зі специфічним антитілом до Ob-Rb (OBR 12-A). Показаний репрезентативний імуноблот для рецептора лептину, який показує два ІЧ-білки розміром 130 і 170 кДа. Зауважте, що кількість білка рецептора лептину не змінювалось у порівнянні з пасажем 15–35. C і D: клітини STC-1 фіксували в 4% параформальдегіді. Імунозабарвлення рецепторів лептину проводили двома різними поліклональними антитілами кролика: TP 283 (C), який розпізнає всі ізоформи Ob-R, та OBR 12-A (D), антисироваткою, специфічною для ізоформи Ob-Rb. Стрілки вказують на сильні сигнали на мембранах клітин STC-1.