Дослідження механізму адипокіну в безалкогольній жировій печінці щурів, які отримували відвар із чотирьох трав

Інформація про статтю

Вей Вей, відділення гастроентерології, лікарня Ванцзин Китайської академії китайських медичних наук, № 6 центральної південної дороги Ванцзин, район Чаоян, Пекін, 100102, Китай. Електронна адреса: [електронна пошта захищена]

Анотація

Метою дослідження є визначення пов'язаного з адіпокіном механізму ефективності відвару Si He (SHD) для лікування неалкогольної жирової хвороби печінки (NAFLD). Сорок п'ять щурів Sprague-Dawley (SD) були випадковим чином розділені на контрольну групу, модельну групу, групу низьких доз SHD, групу середніх доз SHD та групу високих доз SHD. Крім контрольної групи, інші отримували дієту з високим вмістом жиру протягом 12 тижнів для встановлення моделі. Потім проводили фарбування H&E та олійно-червоним O, а для визначення рівня експресії молекул, пов’язаних з адипокіном, використовували імуноферментний аналіз (ELISA). Результати H&E та олійно-червоного фарбування O показали, що лікування SHD для НАЖХП може ефективно покращити патологічні стани печінки порівняно з типом у групі моделей, і найкраща ефективність спостерігалась у групі високих доз SHD. Порівняно з модельною групою, лікування SHD могло ефективно знизити рівень експресії фактора некрозу пухлини-альфа (TNF-α) та інтерлейкіну-6 (IL-6), а також підвищити рівень експресії вісфатину, адипонектину (APN), лептину (LEP), і резистин у щурів NAFLD. SHD може поліпшити NAFLD за допомогою декількох засобів націлювання на адипокіни.

Вступ

Матеріали і методи

Дослідні тварини

У цьому дослідженні було використано 45 чистокровних здорових самців щурів Sprague-Dawley (SD) (специфічного без патогенів (SPF), середня вага тіла = 180 ± 10 г). Ці щури були придбані у Пекінської лабораторії VitalRiver Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (ліцензія № SCXK (Пекін) 2012-0001) та вирощені в Експериментальному центрі для тварин лікарні Дунжимен Пекінського університету китайської медицини. До цих експериментів цих щурів SD годували в експериментальному центрі протягом 1 тижня для адаптації до навколишнього середовища.

Дієта з високим вмістом жиру

Дієта з високим вмістом жиру SPF була придбана у компанії Beijing Keaoxieli Feed Co., Ltd. (ліцензія № SCXK (Пекін) 2009-0012). Дієта з високим вмістом жиру (10 кг на упаковку) складалася з 88% звичайних кормів, 2% холестерину та 10% сала, яке стерилізували кобальтом 60 і зберігали при кімнатній температурі.

Традиційна китайська медицина

Рецепт TCM, Si He Decoction (SHD), був придбаний в аптеці лікарні Ванцзін Китайської академії наук традиційної китайської медицини, який готували для відвару в кімнаті для декорування трав і тестували на обсяг, питому вагу, та гігіологія. Рідкі ліки в 1 мл еквівалентні 2 г сирого препарату. Інгредієнти SHD були наступними: 10 г Bupleurum, 10 г Fructus Aurantii, 30 г східного полину, 9 г гарденії, 6 г готового ревеню, 30 г кореневища східного подорожника, 15 г смаженого Atractylodes macrocephala, 9 г Пінелія, 9 г Магнолія лікарська, 20 г насіння кої, 6 г круглих насіння кардамону, 15 г тальку, 12 г мандаринової цедри, 9 г кореневища чуансіонга, 12 г кореневища горіхової трави, 20 г смаженого Radix Paeoniae Alba і 6 г солодки.

Основні реагенти

Формальдегід (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.), 10% хлоралгідрат, ксилол, еозин та гематоксилін (Beijing Chemical Reagent Co., Ltd.), олійно-червоний O (Sigma) та фізіологічний розчин (Beijing Double-Crane Pharmaceutical Co., Ltd.). Крім того, набір імуноферментного аналізу (ELISA) для вісфатину щурів (синя основа), APN щурів та LEP, набір ELISA для резистину щурів (Senxiong Technologies) та набори ELISA для фактора некрозу пухлини щурів-альфа (TNF-α) та інтерлейкін-щур-6 (IL-6) (Пекін Huanya Tektronix Biomedical Technology Co. Ltd.) також використовувались.

Основні інструменти

Основними інструментами, що використовувались, були автоматична машина для вбудовування парафіну, ультратонкий напівавтоматичний мікротом, заморожуючий мікротом (Leica), мікроскоп та відповідна система фотозйомки (Olympus), криогенний холодильник –80 ° C (Sanyo), електронні ваги (Shanghai Second Balance Instrument Factory), повністю автоматичний багатофункціональний зчитувач мікропланшетів (ThermoFisher), інкубатор з постійною температурою (інструмент Tianjin TAISITE) та стіл для струшування (QILINBEIER).

Експериментальні методи

Експериментальний протокол суворо дотримувався основних експериментальних принципів (рандомізація, контроль та повторюваність) і був затверджений Комітетом з етики лікарні Дунджімен Пекінського університету китайської медицини.

Групування тварин та встановлення моделі NAFLD

Патологічне спостереження тканин печінки щурів

Після 6 тижнів лікування та голодування з питною водою протягом 24 годин з кожної групи випадковим чином відбирали трьох щурів, яким проводили евтаназію. Потім печінку швидко збирали, поміщали на лід і промивали звичайним сольовим розчином. Потім було отримано половину правої частки печінки, обгорнуто станіолем і швидко направлено у відділення патології нашої лікарні для замороженого відділення з подальшим фарбуванням олійного червоного О. Згодом решту половини правої печінки фіксували 4% параформальдегідом, вкладали у парафін, регулярно нарізали та піддавали фарбуванню H&E для спостереження за патологічними змінами в печінці.

Визначення рівнів вісфатину, APN, LEP, резистину, TNF-α та IL-6 методом ІФА

Метод експериментів на тваринах був таким самим, як і в розділі «Дослідні тварини». Після 6 тижнів лікування та голодування питною водою протягом 24 годин у щурів кожної групи відбирали зразки печінки, промивали звичайним сольовим розчином і зважували. До цих зразків додавали 10-кратний об'єм забуференного фосфатом сольового розчину (PBS), подрібнювали, центрифугували і отримували супернатант. Був проведений ІФА з подвійним антитілом, і були виконані конкретні дії відповідно до інструкцій з експлуатації на коробці з реагентом.

Статистичний аналіз

Дані аналізували за допомогою статистичного програмного забезпечення SPSS13.0. Результати були представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (x ¯ ± SD). Спочатку оцінювали нормальний розподіл та однорідність дисперсії даних. Дані вимірювань оцінювали за допомогою t-тесту або дисперсійного аналізу, а дані підрахунку - за допомогою критерію хі-квадрат або непараметричного тесту. P-значення рисунку 1 (а)): тканини печінки мали цілі та чіткі структури, клітини печінки регулярно розташовувались, ядерна структура клітин печінки була цілою, цитоплазма була забарвлена рожевим кольором, запалення не виявлено.

Модельна група (Рисунок 1 (b)): В тканинах печінки виявлено сильне накопичення жиру, структура порушена, спостерігалося набряк і деформація клітин печінки, у цитоплазмі виявлено велику кількість крапель ліпідів, відхилення ядер, спостерігалася інфільтрація великої кількості запальних клітин, а в часточках виявлені некротичні вогнища.

Група з низькими дозами SHD (рисунок 1 (c)): У тканинах печінки виявлено помірне ураження жиру, у клітинах печінки - невеликі крапельки ліпідів, частина клітин печінки набрякла, виявлено інфільтрацію невеликої кількості запальних клітин, а в часточках іноді виявляли некротичні вогнища.

Група середніх доз SHD (Рисунок 1 (d)): Накопичення жиру в тканині печінки зменшилось, структури печінкових часточок були відносно неушкодженими, структури клітин печінки відносно чіткими, некротичних вогнищ не виявлено та інфільтрація невеликої кількості виявлено запальні клітини.

Група з високими дозами SHD (Рисунок 1 (e)): Жирова дистрофія клітин печінки не була очевидною, структури печінкових часточок були відносно неушкодженими, структури клітин печінки відносно чіткими, некротичних вогнищ не виявлено та інфільтрація виявлено невелику кількість запальних клітин (рис. 1).

Рисунок 1. Фарбування H&E тканини печінки серед різних груп (200 ×). (a) контрольна група, (b) модельна група, (c) група SHD з низькими дозами, (d) група SHD із середньою дозою та (e) група з високою дозою SHD.

SHD: відвар Si He.

Група з високими дозами SHD була близькою до контрольної групи за результатами фарбування H&E.

Результати фарбування олійно-червоним O

Контрольна група (рис. 2 (а)): Жодних крапель жиру не виявлено.

Модельна група (Рисунок 2 (b)): Зразки, отримані пластівцево-червоним фарбуванням, велика кількість крапель ліпідів розподілялася в цитоплазмі, а кількість клітин з краплями ліпідів/кількість загальних клітин у печінкових часточках становила 70% –90%.

Група з низькими дозами SHD (рис. 2 (c)): Області забарвлених пунсовим кольором зменшились, а кількість клітин з краплями ліпідів/кількість загальних клітин у печінкових часточках становила 35% –50%.

Група середніх доз SHD (рис. 2 (d)): Пофарбовані червоним кольором області значно зменшились, а кількість клітин з краплями ліпідів/кількість загальних клітин у печінкових часточках становила приблизно 27% -45%.

Група з високими дозами SHD (Малюнок 2 (e)): Пофарбовані червоним кольором ділянки значно зменшились або не були знайдені, а кількість клітин з краплями ліпідів/кількість загальних клітин у печінкових часточках становила приблизно 18% -32%. Результати масляно-червоного фарбування тканин печінки тканин печінки щурів у кожній групі наведені на малюнку 2 .

Малюнок 2. Олійно-червоне фарбування O тканин печінки серед різних груп (200 ×). (a) контрольна група, (b) модельна група, (c) група SHD з низькими дозами, (d) група SHD із середньою дозою та (e) група з високою дозою SHD.

SHD: відвар Si He.

Група з високими дозами SHD була близькою до контрольної групи за результатами фарбування олійно-червоним O.

Експресія адипокінів у печінці щурів у кожній групі

Дані в кожній групі тестували на нормальний розподіл та однорідність дисперсії. Встановлено, що ці дані нормально розподіляються, а дисперсія є однорідною. Потім ці дані порівнювали за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу.

Порівняння рівнів експресії вісфатину

Таблиця 1. Порівняння рівнів експресії вісфатину, APN, LEP, резистину, TNF-α, IL-6 серед різних груп (x ¯ ± SD).

Порівняння рівнів експресії APN

Значення OD та рівень APN у печінці щурів були вищими у групах із високими дозами SHD, середніми дозами SHD та SHD із низькими дозами, ніж у групах контрольної групи, і всі відмінності були статистично значущими (P 9 Лікування SHD може покращити патологію печінки при H&E та масляно-червоному фарбуванні O, а щури у високій дозі SHD мали найкращий ефект поліпшення.

Декларація про суперечливі інтереси
Автор (и) не заявив (-ли) про потенційний конфлікт інтересів стосовно дослідження, авторства та/або публікації цієї статті.

Фінансування
Автор (и) розкрив отримання наступної фінансової підтримки на дослідження, авторство та/або публікацію цієї статті: Проект центральної науково-дослідної установи, що представляє суспільний інтерес, Китайської академії китайської медичної науки (№ ZZ070816).

ID ORCID
Вей Вей https://orcid.org/0000-0001-7821-340X