Дієтичні добавки вітаміну D3 захищають курей-несучок від імунологічного стресу, викликаного ліпополісахаридами

Анотація

Передумови

Вплив вітаміну D на імунну функцію курей-несучок недостатньо вивчений. Це дослідження досліджувало вплив вітаміну D3 (VD3) на продуктивність несучості та імунологічні функції у несучок кишкова паличка виклик ліпополісахаридів (LPS).

Методи

В першому експерименті 360 штамових шарів Jinghong-1 (32 тижні) були випадковим чином розділені на чотири групи з шістьма повторностями на групу і 15 курей на копію. Курей годували базальним раціоном, доповненим різним рівнем VD3 (0; 500; 1500; або 3000 МО VD3/кг раціону) протягом 10 тижнів для визначення продуктивності несучості, якості яєць та інших параметрів. У експерименті два, 24 кури несучок Jinghong (32 тижні) годувались базальними дієтами з 0 або 3000 МО VD3/кг раціону. Після 10 тижнів годування шістьом курям від кожного лікування вводили внутрішньовенно 8 мг/кг маси тіла або ЛФС, або сольового розчину. Зразки крові та селезінки отримували для аналізу імунних параметрів через 4 год після ін'єкції.

Результати

Дефіцит VD3 знижує несучість та якість яєць; крім того, збільшилось споживання корму та співвідношення корму до яєць. Істотних відмінностей у цих параметрах не спостерігалось, крім міцності яєчної шкаралупи між дієтичними додатковими рівнями VD3 при 500; 1500; і 3000 МО VD3/кг дієти. Дефіцит VD3 підвищує рівень сироваткового гормону (кальцитонін, паратиреоїдний гормон, естрадіол та прогестерон) та рівні цитокінів (IL-6, IL-10), співвідношення IFN-γ до IL-4, активність мієлопероксидази та загальний вміст IgG у сироватці крові, і підвищена регуляція популяції CD3 + Т-клітин у крові. Рецептор селезінки X (RXR), ядерний фактор-kB (NF-κB), індукована синтаза оксиду азоту (iNOS) та рівні мРНК гена полімерного імуноглобулінового рецептора (pIgR) були підвищені у курей з дефіцитом VD3. Дефіцит VD3 суттєво знижує концентрацію фолікулостимулюючого гормону (FSH) та лютеїнізуючого гормону (LH) у сироватці крові та кількість CD4 + CD25 + Т-клітин у крові. Ці зміни були повністю нормалізовані завдяки достатності VD3. LPS знижує концентрацію LH у сироватці крові, лізоцим селезінки та рівень мРНК гена pIgR. LPS індукував збільшення загального рівня IgM у сироватці крові та відсотка CD8 + Т-клітин у крові. Зміни були повністю скасовані шляхом додавання VD3.

Висновок

Добавки VD3 можуть захистити курей-несучок не тільки від дефіциту VD3, але і від імунологічного стресу.

Передумови

Курам-несучкам, що вирощуються в інтенсивних комерційних умовах, часто загрожує велика кількість асоційованих з патогенами молекулярних моделей, таких як ліпополісахариди (LPS), отримані з грамнегативних бактерій, і ліпотейхоєва кислота, отримана з грампозитивних бактерій. Вдихання навколишніх грамнегативних бактерій (зокрема, їх ендотоксинів) є основною проблемою здоров'я птиці. Введення ЛПС курям стимулює імунну систему, активізуючи транскрипцію ядерного фактора (NF) -κB, вивільняючи білки гострої фази та прозапальні цитокіни, викликаючи експресію давальницьких рецепторів 2 (TLR2) і 4 (TLR4), а також модуляцію реакцій антитіл [29], крім того, що викликає такі клінічні симптоми, як лихоманка, анорексія та зниження росту [29, 30].

Методи

Заява про етику тварин

Це дослідження, яке відповідало інституційним та національним рекомендаціям щодо догляду та використання тварин, було схвалено Комітетом експериментів на тваринах Китайського сільськогосподарського університету. Всі зусилля було докладено до мінімізації страждань тварин.

Модель тварини та експериментальні методи лікування

Аналіз проточної цитометрії

Аналіз кальцію та 25-гідроксихолекальциферолу в сироватці крові

Загальний вміст кальцію в сироватці крові (мМ) вимірювали за допомогою видимого спектрофотометра UV-2000 (Unico Instruments Co. Ltd., Шанхай, Китай) за допомогою комерційних наборів для колориметричного аналізу (Інститут біоінженерії Нанкін Цзяньчен, Нанкін, Китай).

Для визначення 25-гідроксихолекальциферолу в сироватці крові (25 (OH) D) зразки сироватки розділяли центрифугуванням при 894 × g протягом 15 хв і заморожували при - 20 ° C. Для оцінки 25 (OH) D, як описано раніше [33], використовували ультрависокопродуктивну рідинну хроматографію – тандемну мас-спектрометрію. Стандартну криву отримували з використанням розведень стандарту 25 (OH) D (Iso Sciences, США).

Аналіз на гормони сироватки крові

Визначали рівні кортикостерону (CORT), кальцитоніну (CT), паратиреоїдного гормону (PTH), естрадіолу (E2), фолікулостимулюючого гормону (FSH), лютеїнізуючого гормону (LH), тестостерону (T) та прогестерону (PG) у сироватці крові. з комерційними наборами радіоімунологічного аналізу (RIA) відповідно до інструкцій виробника (Пекінський північний інститут біологічних технологій, Пекін, Китай).

Комплемент сироватки та аналіз на цитокіни

Мієлопероксидаза сироватки (MPO), компоненти комплементу (C3, C4, C5) вимірювали за допомогою комерційного набору (Інститут біоінженерії Нанкін Цзяньчен). Концентрацію інтерлейкінів у сироватці крові (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10), інтерферону-γ (IFN-γ) та фактора некрозу пухлини-α (TNF-α) визначали комерційно доступні набори ELISA для курячих цитокінів (Пекінський північний інститут біологічних технологій), згідно з протоколом виробника. У кожному аналізі контрольний рекомбінантний курячий цитокін розводили у рекомендованому діапазоні виявлення, щоб сформувати стандартну криву, і лінійність розраховували за допомогою Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA). Р. 2 = 0,99. Концентрації зразків інтерполювали зі стандартної кривої.

Визначення загальних IgG та IgM у сироватці крові

Рівні загального рівня IgG та IgM у сироватці крові визначали кількісно за допомогою наборів ELISA для курячих IgG та IgM (Bethyl Laboratories, Inc., Монтгомері, Техас, США) відповідно до процедури виробника. Зразки сироватки розводили 1: 125 000 для визначення IgG або 1: 10000 для визначення IgM. Планшети зчитували за допомогою зчитувача планшетів ELISA (SepctraMax® i3x Platform, Molecular Devices, LLC, Сан-Хосе, Каліфорнія, США) при 450 нм, і концентрації антитіл у сироватці крові розраховували за допомогою програмного забезпечення Gen 5 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, США).

Кількісна ПЛР у режимі реального часу для вимірювання рівня імунозалежних транскриптів генів у селезінці

Статистичний аналіз

В першому експерименті в якості експериментальної одиниці використовували копію. Дані піддавали односторонній ANOVA, використовуючи процедуру GLM SPSS 17.0 для Windows (SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс, США). Засоби лікування були розділені багаторазовими тестами Дункана на P

Результати

Вплив дефіциту VD3 та достатності VD3 на несучість та якість яєць

Результати аналізу даних про виробничі характеристики наведені в таблиці 3; курей, що харчувались без дієтичних добавок VD3, спостерігалося значне зменшення (P 0,05) відмінності у вищезазначених параметрах курей-несучок між дієтичними додатковими рівнями VD3 при 500 МО; 1500 МО і 3000 МО/кг дієти.

Порівняно з групою дефіциту VD3, дієтичне добавлення VD3 значно (P 0,05) вплив на одиницю Хо, колір яєчної шкаралупи та колір жовтка (таблиця 4). Міцність яєць у несучок з 1500 МО і 3000 МО/кг дієтичного VD3 була значно більшою, ніж у курей, які годували 500 МО VD3/кг раціону.

Рівень кальцію та 25-гідроксихолекальциферолу в сироватці крові

Відмічено значне зниження рівня кальцію в сироватці крові (2,00 ± 0,98 мг/дл проти 2,28 ± 1,17 мг/дл; P Рис. 1

дієтичні

Концентрація гормонів у сироватці крові

Концентрації гормонів у сироватці крові показали (табл. 5), що не було виявлено значущих взаємодій дієти × викликів у рівнях CORT, CT, PTH, FSH, E2, T та PG: LH був винятком. Кури, яким вводили ЛПС, які годувались дієтами з добавкою VD3, показали найвищий рівень ЛГ у сироватці крові (P Таблиця 5 Вплив вітаміну D3 на біохімічну сироватку крові та гормони несучок, заражених LPS *

Порівняно з курями, яким вводили фізіологічний розчин, ін’єкції ЛПС значно зменшились (P 0,05) на ПТГ та ФСГ. Порівняно з групою з дефіцитом VD3, дієтичні добавки VD3 значно зменшились (P 0,05) на рівні CORT та T у сироватці крові.

Активність МРО в сироватці крові

Як показано в таблиці 6, виклик LPS призвів до зниження MPO (P 0,05) порівняно з іншими методами лікування.

Концентрація сироваткового комплементу, IgG та IgM

Як показано в таблиці 6, ін'єкція ЛПС значно зменшилася (P 0,05) порівняно з групами з дефіцитом VD3.

Популяція Т-лімфоцитів у крові

Як показано в таблиці 7, порівняно з курями, яким вводять фізіологічний розчин, ін’єкції ЛПС значно зменшуються (P +, CD4 + і CD8 + Т-клітини в крові і суттєво зросли (P + CD25 + Т-клітини після виклику LPS.

Достатня добавка VD3 значно зменшилася (P + Т-лімфоцити та збільшення популяції CD4 + CD25 + Т-клітин (P + Т-клітини в крові між дієтичним лікуванням VD3 та викликом LPS. Кури, яким вводили ЛПС, які годували раціоном з додатковим VD3, демонстрували найнижчі показники (P + Т-клітини в крові порівняно з іншими трьома групами лікування.

Рівні цитокінів у сироватці крові

Щоб визначити, чи може VD3 чинити протизапальну дію на курей, ми оцінили вплив VD3 на LPS-індуковану запальну реакцію шляхом вимірювання TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL- 6, концентрації IL-8 та IL-10 у сироватці, обробленій LPS із VD3 або без нього. Порівняно з контрольованими курями, введеними фізіологічним розчином, ін’єкція ЛПС значно (P Таблиця 8 Вплив виклику вітаміну D3 та LPS на сироваткові цитокіни несучок, заражених LPS *

Експресія генів, пов'язаних з імунітетом селезінки

Вплив дієтичних добавок VD3 на VDR, RXR, TLR-2, TLR-4, NF-κB, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, LYZ, iNOS та pIgR Рівень транскриптів генів у селезінці курей після впливу LPS представлений у таблиці 9. Рівні експресії генів TLR4, NF-κB та IL-6 були помітно підвищені (P 0,05) рівні експресії VDR, TLR-4, TNF-α, IL-1β, IL-6 та IL-8 у селезінці курей порівняно з курями, що не отримують добавки.

Обговорення

Наше дослідження показало, що дефіцит VD3 значно знижує продуктивність несучості та якість яєць. Однак додавання VD3 на 500 МО; 1500 МО; і повідомлялося, що 3000 МО/кг базової дієти суттєво збільшували несучість, масу яєць та якість яєць; отже, FCR був покращений порівняно з курями з дефіцитом VD3. Більше того, кури, які годували раціоном, що містив 1500 МО і 3000 МО VD3/кг раціону, мали міцнішу шкаралупу яєць, ніж птахи, яким давали 500 МО VD3/кг раціону. Відповідно до наших висновків, подібні висновки щодо продуктивності були повідомлені в попередніх дослідженнях [34,35,36], де швидкість виробництва, добова вага яєць та споживання корму не відрізнялися. Інші дослідження [37, 38] не повідомляли про суттєві відмінності в продуктивності несучості та якості яєць серед різних рівнів добавок VD3 у раціоні. Таким чином, наші результати показали, що придатна додаткова доза VD3 для курей-несучок середньої фази становить від 500 до 3000 МО/кг раціону. Крім того, зниження несучості та ваги яєць, а також більш високий рівень смертності у курей з дефіцитом VD3, ймовірно, зумовлений змінами мікробіоти кишечника, впливом на ліпідний обмін печінки та зниженням ефективності використання енергії (неопубліковані дані).

25 (OH) D - основна циркулююча форма вітаміну D і використовується як індикатор стану вітаміну D [39]. У нашому дослідженні концентрація 25 (OH) D і кальцію в сироватці крові була значно нижчою у птахів з дефіцитом VD3 порівняно з птахами, що мають достатню кількість VD3, що було узгоджено з попередніми дослідженнями на мишачих моделях [40]. І навпаки, концентрації 25 (OH) D, що зростали у відповідь на дієтичні добавки VD3 у нашому дослідженні, супроводжувались підвищенням концентрації кальцію в сироватці, як показали результати інших дослідників у курей [41,42,43]. Роль VD3 у метаболізмі кальцію та фосфору має вирішальне значення для його добре задокументованої участі у формуванні кісток та яєчної шкаралупи у несучок [44]. Наші результати показали, що кури, що харчуються без дієтичних добавок VD3, показали значне зниження несучості, а також низьку якість яєць, тоді як добавка VD3 значно покращила несучість та товщину і міцність шкаралупи яєць. Ці зміни супроводжувались підвищенням концентрації кальцію та 25 (OH) D у сироватці крові, що означає, що дефіцит VD3 може вплинути на метаболізм кальцію та VD3 та порушити процес утворення яєчної шкаралупи.

Природні антитіла є важливими компонентами вродженої імунної системи, і вони присутні в організмі без відомої антигенної стимуляції В-клітин [56]. У нашому дослідженні дефіцит VD3 сприяв виробленню сироваткових IgG, тоді як добавки VD3 значно змінили цю зміну. Це узгоджується з іншими висновками [57], що вказують на регулювання VD3 регульованого вироблення IgG, спричиненого Т-клітинами, або пригнічення вироблення антитіл, запобігаючи проліферації активованих В-клітин [24, 58, 59]. Однак у курей, яким не вводили ЛПС, добавки VD3 асоціювались із значним збільшенням сироваткового IgM, тоді як нижчий рівень загального IgM спостерігався у курей, яким вводили ЛПС та годували достатньою кількістю VD3. Це спостереження припустило, що добавки VD3 можуть бути корисними для підвищення вродженого гуморального імунітету курей, що вирощуються в безперечно оточуючому середовищі, одночасно протидіючи запальній реакції, коли стикається з неадекватною та надмірно бурхливою імунною реакцією, спричиненою LPS, через пригнічення вироблення IgM [60]. Отже, VD3 може бути корисним імунним регулятором у виробництві шарів.

Висновок

Наше дослідження показало, що дефіцит VD3 спричинив зниження несучості, погану якість яєчної шкаралупи та запальні реакції у курей-несучок. Дієтичні добавки, що містять VD3, можуть покращити несучість та якість яєць. Добавки можуть також придушити імунні запальні реакції, спричинені введенням LPS або дефіцитом VD3, впливаючи на секрецію репродуктивного гормону та регулюючи сигнальний шлях NF-κB. Таким чином, добавки VD3 можуть бути корисними для захисту курей-несучок як для запобігання імунологічного стресу, так і для дефіциту VD3. Ми плануємо додатково дослідити потенційні механізми дії, пов'язані з протизапальним ефектом VD3 у курей.