Дієта з високим вмістом жиру у матері впливає на рівень експресії білків, залежних від вітаміну К, нащадків

Affiliation Bone і Спільна дослідницька група, Розвиток людини та здоров'я, Інститут наук про розвиток, Медичний факультет, Університет Саутгемптона, Саутгемптон, Великобританія

Дослідницька група з питань матері, вагітності та дитини, Інститут розвитку людини, Медичний факультет, Університет Саутгемптона, Саутгемптон, Великобританія

Стюарт Ленхем,
Феліно Р. Кагампанг,
Річард О. С. Ореффо

Цифри

Анотація

Дослідження показують, що на ріст та розвиток кісток та сприйнятливість до судинних захворювань у подальшому житті впливає харчування матері, протягом внутрішньоутробного та раннього постнатального життя. Є дані про роль вітамін K-залежних білків (ВКПД), включаючи остеокальцин, білок Matrix-gla, Periostin та Gas6, у розвитку кісток та судин. Це дослідження розширює аналіз VKDP, проведений раніше у 6-тижневого потомства, у потомство віком 30 тижнів, щоб оцінити довгострокові наслідки дієти з високим вмістом жиру у матері та після пологів на експресію VKDP. Загалом ВЧ-дієта для матері та дієта для потомства погіршили спостерігаються кісткові зміни. Статеві та специфічні для тканини відмінності спостерігались у експресії ВКПД як для аорти, так і для стегнової тканини. Крім того, спостерігались значні кореляційні зв’язки між рівнями ОКН стегнової кістки, рівнем експресії Periostin Gas6 та Vkor та показниками структури стегнової кістки. Крім того, рівні експресії MGP, OCN, Ggcx та Vkor корелювали з масою та обсягом жиру у обох статей. Підводячи підсумок, поточне дослідження підкреслило важливість довгострокових наслідків материнського харчування на розвиток кісток потомства та кореляцію ВКПД із структурою кісток.

Цитування: Lanham S, Cagampang FR, Oreffo ROC (2015) Дієта з високим вмістом жиру у матері впливає на рівень експресії білків, залежних від вітамінів K, нащадків. PLoS ONE 10 (9): e0138730. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138730

Редактор: Клаудія Мієле, Національний консільйо де Річерше, ІТАЛІЯ

Отримано: 3 липня 2015 р .; Прийнято: 2 вересня 2015 р .; Опубліковано: 18 вересня 2015 р

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Фінансування: Фонд Rosetrees Trust, номер гранту M425 (http://www.rosetreestrust.co.uk), що фінансується SL. Рада з досліджень біотехнологій та біологічних наук, номер гранту BB/G01812X/1 (http://www.bbsrc.ac.uk), що фінансується FC. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Залежні від вітаміну К білки (ВКПД) складаються щонайменше з 16 відомих білків з різною роллю, включаючи фактори, що беруть участь у згортанні крові (такі як фактори VII та X) та антикоагуляцію (наприклад, білки С і S). Однак інші ВКПД виконують надзвичайно важливу роль в інших органах, тоді як, як повідомляється, чотири ВКПД виконують ключову роль як у кістковій, так і в судинній тканинах, із змінами у вираженні, що призводять до патологій захворювання [1].

Зараз є дані, що кістка може діяти як ендокринний орган, впливаючи на інші органи, при цьому остеокальцин (OCN) бере участь у цьому процесі [2–4]. OCN - гормон, що секретується остеобластами, який підвищує чутливість до інсуліну та вироблення, таким чином, підвищуючи споживання глюкози та витрати енергії [5].

Білок Matrix gla (MGP) еволюційно пов'язаний з OCN [6], отже, може мати гормональні властивості. Однак MGP міститься в організмі та запобігає кальцифікації таких тканин, як легені, нирки, коронарні артерії та аорта [7]. VKDP Periostin важливий для росту кісток [8] та важливий для розвитку серця [9]. Періостин присутній у сполучних тканинах, що піддаються механічним зусиллям (наприклад, клапани серця), і присутній у клубочках у пацієнтів з нефропатією [10]. Періостин також сильно регулюється після пошкодження серцевої тканини [8].

Нарешті, специфічний для зупинки росту білок 6 (Gas6) регулює сукупність процесів, включаючи виживання та проліферацію клітин, адгезію та міграцію клітин, стабілізацію згустків крові та запалення цитокінів. Нещодавно було показано, що експресія Gas6 регулює хондрогенну диференціацію [11] і пов'язана зі зміною толерантності до глюкози, запаленнями [12], незначними для гестаційного віку [13], а також серцево-судинними захворюваннями [14]. На додаток до цих ВКПД, сам вітамін К показав, що є ключовим у згортанні, а також відіграє ряд ролей у зростанні та розвитку кісток [15]. Недавнє дослідження, проведене серед хворих на діаліз, свідчить про дефіцит вітаміну К як про можливу причину переломів хребців та кальцифікації судин [16].

Крім того, для роботи ВКПД необхідні принаймні два ферменти; i) гамма-глутамілкарбоксилаза (Ggcx), яка опосередковує залежне від вітаміну K карбоксилювання залишків глутамату до залишків гамма-карбоксиглутамата (Gla), що зв’язує кальцій, перетворюючи тим самим гідрохінон вітаміну K в епоксид та, ii) едуксид редуктази вітаміну K (Vkor ), який знижує неактивний епоксид вітаміну К до активного гідрохінону вітаміну К через вітамін К [17].

Епідеміологічні дослідження та дослідження на тваринах вказують на те, що фактори навколишнього середовища, такі як харчування матері, впливають на ризик захворювання у подальшому житті [18–21]. Дійсно, численні дослідження показали, що внутрішньоутробне обмеження росту, проксі-показник поганого внутрішньоутробного середовища, може впливати на серцево-судинний та метаболічний контроль у тварин та людей у багатому поживному середовищі після пологів [22–25]. Крім того, порушення функції судинної системи може призвести до ряду захворювань, включаючи гіпертонію, атерогенез, діабет 2 типу, ішемічну хворобу серця, метаболічний синдром та ожиріння. Критично важливо, що на ризик та розвиток цих захворювань впливає материнське харчування під час вагітності; зазвичай називають концепцією витоків розвитку [20]. Вважається, що основні механізми включають епігенетичні модифікації, що призводять до довічних змін у експресії генів [26].

Раніше ми оцінювали вплив дієти з високим вмістом жиру у матері та дітей на білки ВКД в аорті та кістках від мишей 6 тижнів [27]. Дані, представлені в цьому дослідженні, поширюють ці дослідження на аналіз, проведений у потомства у віці 30 тижнів.

Матеріали і методи

Експериментальний дизайн та догляд за тваринами

Усі миші були вирощені в Університеті Саутгемптона, Біомедичні дослідні установи, і їх розміщували у відповідних умовах у приміщеннях з температурою 22 ± 2 ° C з 12 годинним світлом: 12 годин темного циклу.

Етична заява

Усі процедури на тваринах відповідали вимогам Закону Сполученого Королівства про тварини (про наукові процедури) 1986 року та проводились за ліцензією проекту Міністерства внутрішніх справ за номером 30–2968. Дослідження отримало інституційне схвалення від Комітету з етики досліджень Біомедичних досліджень Університету Саутгемптона.

Дієта з високим вмістом жиру

У віці 10 тижнів 11 самок мишей штаму C57BL/6 були спарені з самцями C57BL/6, що відповідали старі. Самки спарювались з окремими самцями, і після підтвердження спаровування (наявність вагінальної пробки) були індивідуально розміщені та годувались або стандартною контрольною чау (C, n = 5 дам) дієтою RM-1 (Special Diet Services, Witham, Essex, Великобританія) або дієта з високим вмістом жиру (СН, n = 6 дам) (дієта спеціальних дієт 824053, спеціальна дієта). Ми використовували ці дієти в попередньому дослідженні [27]. Ці дієти з вмістом СН та СН продовжувались протягом усієї вагітності та лактації, поки потомство не було відлучене у віці від 3 тижнів. Потім відлучене потомство додатково розподіляли, щоб забезпечити кожну батьківську дієтичну групу потомством, яке годували або контролем (C/C або HF/C групи), або дієтою з високим вмістом жиру (C/HF або HF/HF групи). Одностатеві однолітки на одній і тій же дієті після відлучення були розміщені разом. Для всіх груп n = 10–12 тварин, з n = 5–7 чоловіків чи самок на групу. Цю дієту продовжували ще протягом 27 тижнів до моменту відбору проб у віці 30 тижнів. Тварин було вбито вивихом шийки матки.

3D комп’ютерна томографія

Цілих тварин сканували за допомогою мікроскопічного сканера in vivo Skyscan 1176 (Bruker microCT, Контіч, Бельгія). Всі скани були зроблені при 50 кВ, 500 мкА з алюмінієвим фільтром 0,5 мм, з кроком обертання 0,5 °. Індивідуальні 2D-зображення поперечного перерізу реконструйовані за допомогою програмного забезпечення Bruker NRecon версії 1.6.5.8. Роздільна здатність Вокселя становила 18 мкм. Відновлені зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення Bruker CTAn версії 1.13.5.1 з відповідними пороговими значеннями для визначення обсягів жиру, м’яких тканин та кісток. Для хребця аналізували тіло хребця L3. Для стегнової кістки аналізували ділянку висотою 0,35 мм і 1,8 мм за пластиною росту на дистальному кінці.

Вимірюваними параметрами трабекули були BvTv (об’єм кістки в межах вимірюваного загального об’єму), BsBv (відношення поверхні до об’єму трабекулярної кістки), товщина трабекули, трабекулярний інтервал (відстань між трабекулами), показник структурної моделі (SMI, показник опуклості поверхні, де нижчий SMI вказує на більш зв’язані, пластинчасті трабекули), коефіцієнт трабекулярного малюнка (показник зв’язку трабекул, де значення, ближчі до нуля, як позитивні, так і негативні, представляють більш зв’язану структуру).

Збір зразків

Після КТ (див. Вище) видалили грудну аорту та ліву стегнову кістку. Ліву стегнову кістку очищали від м’яких тканин, розрізали навпіл, і кістковий мозок промивали за допомогою PBS через голку тонкого калібру. Потім половинки розрізали на менші шматочки. Після обробки шматочки кісток аорти та стегнової кістки негайно поміщали в реагент Trizol (Invitrogen).

Вилучення РНК та отримання кДНК

РНК виділяли із зразків у реагенті Trizol (Invitrogen) згідно з інструкціями виробника. Концентрацію та чистоту РНК визначали за оптичними щільностями при 230 нм, 260 нм та 280 нм за допомогою спектрофотометра NanoDrop (Labtech, Uckfield, Великобританія) та кДНК, отриманої з 500 нг РНК за допомогою набору синтезу кДНК Superscript VILO (Invitrogen), дотримуючись інструкцій виробника.

Кількісна ПЛР

Відносну кількісну оцінку експресії генів проводили за допомогою системи виявлення ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Warrington, UK). Готували 20 мкл реакційної суміші, що містила 1 мкл комплементарної ДНК, 10 мкл Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) і 250 нМ кожного праймера. Умови термічного циклера полягали в початковій стадії активації при 95 ° C протягом 10 хв, після чого проводилася двоступенева програма ПЛР 95 ° C протягом 15 с і 60 ° C протягом 60 с протягом 40 циклів. Крива дисоціації була отримана для кожного циклу. Для відносної кількісної оцінки експресії генів у порівнянні з чоловічою групою C/C застосовували метод 2 ΔΔCt, а дані нормалізували до експресії гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (Gapdh) (яка не змінювалася між групами). Праймери миші, що використовувались для qPCR, були: Gapdh вперед, AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; реверс, TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; Mgp вперед, TCAACAGGAGAAATGCCAACAC; реверс, CGGTTGTAGGCAGCGTTGT; OCN вперед, CTGACCTCACAGATGCCAAGC; реверс, TGGTCTGATAGCTCGTCACAAG; Газ6 вперед, TGCTGGCTTCCGAGTCTTC; реверс, CGGGGTCGTTCTCGAACAC; Періостин вперед, CCTGCCCTTATATGCTCTGCT; реверс, AAACATGGTCAATAGGCATCACT; Ggcx вперед, GTTGCTCCCGCCTCAGATAAA; реверс, TAAGCAGGGTCACGACACTCT; Vkor вперед, GCTGGCTTAGCCCTCTCAC; реверс, CTGTCCGCTCCTAGCATGT .

Статистика

Спостерігалося, що всі дані для всіх груп дієт нормально розподіляються за допомогою тесту Шапіро-Вількса. Ефект дієти та статі матері та нащадків визначали за допомогою тристоронньої ANOVA з подальшим пост-спеціальним тестом Бонферроні з використанням PASW версії 21 (SPSS UK, Woking, Surrey, United Kingdom). Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, якщо не вказано інше; значимість визначали з рівнем р 0,05 або нижче. Для кожної дієтичної групи використовували принаймні 4 дамби. Взаємозв'язок між змінними випробовували за допомогою аналізу лінійної регресії (одноваріантної та багатоваріантної), де p p Рис. 1. Маса та склад тіла потомства протягом тридцяти тижнів.

Графіки показують (А). Маса (Б). Жир, тканини та кістки. (С). Відсоток жиру, тканин та кісток. У межах кожної статі та для кожного типу тканин смужки з різними літерами суттєво відрізняються (p Таблиця 1. Лінійний регресійний аналіз між рівнями експресії білка, залежного від вітаміну К стегнової кістки, та складом тіла.

Жіноче потомство.

Для жіночого потомства ВЧ-дієта нащадків, як окрема, так і в поєднанні з ВЧ-дієтою матері, збільшувала масу нащадків вище контрольних рівнів (C/HF або HF/HF, обидві p Рисунок 2. Будова кісток стегна у тридцять тижнів віку.

Для дієтичної групи та статі наведені результати для (А). Довжина стегнової кістки. (В). Об'єм кістки стегнової кістки. (С). Товщина стінки середнього вала. (D). Діаметр середнього валу. (Е). Щільність кісток чоловічого стегна. (F). Щільність кісток жіночої стегнової кістки. Для графіків щільності діапазон щільності кісткової тканини 80–140 являє собою трабекулярну кістку, а 140–220 - кіркову кістку. Для всіх груп n = 5–7 на групу. Графіки показують середнє значення плюс 95% межі довіри.

Жіноче потомство.

Для дієтичної групи та статі наведені результати для (А). Об'єм кісток тіла хребців. (В). Довжина тіла хребця. (С). Відношення поверхні кістки до об’єму. (D). Трабекулярна товщина. (Е). Трабекулярний інтервал. (F). Щільність кісток чоловічого хребця у самця. (G). Щільність кісток жіночого цілого хребця. Для графіків щільності діапазон щільності кісткової тканини 80–140 являє собою трабекулярну кістку, а 140–220 - кіркову кістку. Для всіх груп n = 5–7 на групу. Графіки показують середнє значення плюс 95% межі довіри.

Жіноче потомство.

Для жіночого потомства не було помічено суттєвих відмінностей у порівнянні з контролем C/C в будь-якій іншій групі потомства в обсязі хребцевої кістки (Рис. 3А права панель), довжині тіла хребців (Рис. 3B права панель) або трабекулярному інтервалі (Рис. 3E праворуч) панель). Однак спостерігалося зменшення співвідношення поверхні трабекулярної кістки до об’єму у всіх групах потомства порівняно з контролем C/C (рис. 3C, права панель), найбільше зменшення відбулося у групі C/HF. Було відповідне значне збільшення товщини трабекули в обох групах потомства на постнатальній ВЧ дієті порівняно з контролем C/C (Рис. 3D, права панель), причому найбільша товщина спостерігалася в групі C/HF. Порівняно з контролем C/C, потомство C/HF також продемонструвало збільшення співвідношення обсягу трабекулярної кістки до загального обсягу (табл. 2) та зменшення фактора трабекулярного малюнка. Що стосується щільності кісток, групи потомків із ВЧ-дам (HF/C та HF/HF) показали значно вищу площу кісток, порівняно з групами потомків із C-годуваних дам (C/C та C/HF), для діапазону 80–120 (p Рис. 4. Середній рівень відносної експресії генів в аорті для мишей тридцяти тижнів.

Експресію гена визначали за допомогою qPCR. Графіки показують експресію генів для (A). MGP, (B). Періостин, (С). Газ6, (D). Ggcx та (E). Vkor. Експресія гена показана щодо чоловічої групи C/C. Для всіх груп n = 5–7 на групу. Графіки показують середнє значення плюс 95% межі довіри.

Жіноче потомство.

Рівні експресії Mgp, Periostin, Gas6, Ggcx та Vkor в аорті представлені на рис. 4 (права панель). Рівні експресії MGP були значно вищими у нащадків жіночої статі HF/C порівняно з контролем C/C (p = 0,007, рис. 4А, права панель). Істотних відмінностей у рівнях експресії Periostin, Gas6 або Vkor не виявлено. Рівні експресії Ggcx були значно вищими у потомків HF/HF порівняно з усіма іншими групами (p = 0,01 для контролів, p = 0,002 для HF/C та C/HF, рис. 4D, права панель).

ВКПД в стегновій кістці

Чоловіче потомство.

Рівні експресії мРНК Mgp, OCN, Periostin, Gas6, Ggcx та Vkor у стегновій кістці показані на рис. 5 (ліві панелі). Рівні експресії MGP були значно вищими у групі HF/HF порівняно з HF/C (p = 0,01) та C/HF (p = 0,04) нащадків, хоча не для контрольних груп (рис. 5А, ліва панель). Рівні OCN були значно вищими у нащадків чоловічої статі HF/HF порівняно з групами HF/C та C/HF (обидва p Рис. 5. Середній рівень відносної експресії генів у стегновій кістці для мишей у віці тридцять тижнів.

Експресію гена визначали за допомогою qPCR. Графіки показують експресію генів для (A). MGP, (B). Остеокальцин, (С). Періостин, (D). Газ6, (E). Ggcx та (F). Vkor. Експресія гена показана щодо чоловічої групи C/C. Для всіх груп n = 5–7 на групу. Графіки показують середнє значення плюс 95% межі довіри.

Жіноче потомство.

Рівні експресії MGP були значно вищими у ВЧ/ВЧ жіночих нащадків порівняно з групами контролю C/C (p = 0,02) та HF/C (p = 0,002) (рис. 5А, права панель). Рівні OCN у нащадків жінки були значно вищими, ніж у контрольній групі з ВЧ/ВЧ (р = 0,02, рис. 5В, права панель). Рівні експресії періостину були значно нижчими у нащадків C/HF порівняно з усіма іншими групами дієти (p = 0,002 для контролів, p = 0,03 для HF/C та p = 0,002 для HF/HF, рис. 5C, права панель). Ніяких відмінностей у рівнях експресії Gas6 не виявлено. Рівні експресії Ggcx були суттєво підвищені у групі HF/HF порівняно з іншими трьома групами дієт (усі p Таблиця 3. Лінійний регресійний аналіз між рівнями експресії білка, залежного від білка стегнової кістки, та кістковими структурними факторами стегнової кістки або 3-го поперекового хребця.