Дієта з високим вмістом жиру до і під час вагітності спричиняє помітне регулювання транспорту поживних речовин плаценти та заростання плоду у мишей C57/BL6

Хелен Н. Джонс

* Кафедра гінекології та акушерства і

вмістом

Лора А. Вуллетт

* Кафедра гінекології та акушерства і

Ніколетт Барбур

* Кафедра гінекології та акушерства і

Путтур Д. Прасад

* Кафедра гінекології та акушерства і

Тереза ​​Л. Пауелл

* Кафедра гінекології та акушерства і

Томас Янссон

* Кафедра гінекології та акушерства і

Анотація

Заростання плода призводить до народження дитини великого для гестаційного віку (LGA) дитини, яка зазвичай визначається як вага при народженні> 90-го сантиля і зустрічається в ~ 10% всіх вагітностей (1). Немовлята LGA мають підвищений ризик розвитку ожиріння та метаболічного синдрому в дитячому та юнацькому віці (2, 3), що сприяє збільшенню захворюваності на діабет (4), який зараз спостерігається у всьому світі. Хоча в декількох дослідженнях повідомлялося про зв'язок між ожирінням під час вагітності та обмеженням внутрішньоутробного розвитку (5), типовим результатом щодо росту плода при вагітності жінок із ожирінням та ожирінням є надмірне зростання плоду (6,7,8). з підвищеним індексом маси тіла (ІМТ) у 2–3 рази частіше народжують велику дитину (9), що представляє значну медичну проблему, враховуючи, що> 50% всіх американських жінок вступають у вагітність із надмірною вагою (ІМТ 25–29,9 кг/м 2) або ожирінням (ІМТ≥30 кг/м 2) (9).

Споживання енергії матерями, включаючи загальне споживання жиру, підвищене у вагітних із надмірною вагою та ожирінням як у першому, так і в третьому триместрі (10). Таким чином, створюється «порочний цикл», коли жінки із зайвою вагою та ожирінням споживають дієту, багату енергією, жирами та вуглеводами, народжуючи великих дітей. У цих немовлят частіше розвивається ожиріння та діабет у подальшому житті, а у жінок - вони схильні до виношування великої дитини, коли вони завагітніють (7, 8, 11). Заходи щодо полегшення заростання плоду у цих жінок є стратегією раннього втручання, яка може сприяти зменшенню поширеності ожиріння та діабету в наступних поколіннях. Однак відсутність відповідних моделей тварин для вивчення механізмів заростання плоду при цих вагітностях перешкоджає досягненню успіху в цій галузі.

На ріст плода сильно впливає надходження поживних речовин, яке залежить від плацентарних транспортних функцій. Відомо, що активність транспортера поживних речовин плаценти змінюється у випадках ненормального росту плода, і ці зміни можуть безпосередньо сприяти зміні швидкості росту плода (12, 13). Заростання плода під час вагітності, ускладненої діабетом 1 типу (14), але не гестаційним цукровим діабетом (GDM) (15), пов’язане із збільшенням активності плацентарного транспортера глюкози та експресії білка. Здатність плаценти транспортувати незамінний амінокислотний лейцин збільшується в GDM, ускладненому переростанням плода (16) та плацентарною системою. Повідомляється, що активність транспортера амінокислот збільшується як при діабеті 1 типу, так і при GDM (16). На відміну від цих висновків, попереднє дослідження показало, що активність системи A знижена, а активність системи L незмінена у везикулах мікровілозної плазматичної мембрани (MVM), виділених з діабетичної вагітності 1 типу з дітьми LGA (17). Однак наразі відсутні дані щодо функції плацентарного транспорту під час вагітності, пов’язаної з підвищенням ІМТ матері.

У порівнянні з жінками з нормальним ІМТ, жінки з надмірною вагою та ожирінням у третьому триместрі (10, 18, 19) підвищували сироваткові концентрації інсуліну, інтерлейкіну-6 (IL-6) та лептину та знижували рівень адипонектину (10, 18, 19). зміни вже є у першому триместрі (10). Попередні дослідження продемонстрували, що лептин та інсулін стимулюють активність транспортера амінокислот системи A у первинних фрагментах ворсинок та культивованих клітинах трофобластів (20, 21). Так само було показано, що плацентарні транспортери глюкози у первинних фрагментах ворсинок, отриманих на ранніх термінах вагітності, регулюються in vitro за допомогою інсуліну (22). Отже, зміни рівня материнських рівнів цих регуляторних факторів у вагітних із надмірною вагою та ожирінням можуть впливати на шляхи транспортування плацентарних поживних речовин і збільшити надходження поживних речовин до плоду, що розвивається.

Існує небагато опублікованих моделей ожиріння на тваринах під час вагітності, які мають ключові особливості стану людини, тобто збільшення ожиріння матері без діабету, підвищення рівня метаболічних гормонів у матері, низький рівень адипонектину та надмірне зростання плода. Отже, метою цього дослідження було розробити модель миші, яку годували дієтою з помірним вмістом жиру до і протягом гестації, що призвело до переростання плоду та пов'язано з материнським середовищем, що відображає те, що було виявлено у вагітної з підвищеним ІМТ. Одного разу встановивши, ми використали модель для перевірки гіпотези про те, що механізми, що лежать в основі заростання плода, включають посилений транспорт поживних речовин плаценти.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Тварини та дієти

Усі протоколи були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Університеті Цинциннаті. Вісім тижневих самок мишей C57/BL6 (лабораторія Джексона, Бар-Харбор, штат Мексика, США) були розміщені в клітці 4/клітку в захисному корпусі PIV і згодом годувались дієтою з високим вмістом жиру (ВЧ) (32% енергії з жиру), 52% від вуглеводів і 16% від білків; номер каталогу D12266B) або контрольна (C) дієта (11% енергії від жиру, 73% від вуглеводів і 16% від білка; каталог за номером D12489B) протягом 8 тижнів. Дієти були придбані у Research Diets (Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США). Щоденне споживання їжі оцінювали шляхом зважування залишку їжі в кінці кожного тижня і використовували для обчислення добового споживання калорій. Після 8 тижнів годування цими дієтами мишей зважували і спаровували. Самок щодня перевіряли на наявність проб у посткопуляційному режимі. Наявність пробки представлена ​​ембріональним днем ​​(Е) 0,5. При E18.5 дамби зважували, а потім використовували або для збору зразків крові та тканин, тестів на толерантність до глюкози або досліджень транспортування плаценти in vivo.

Забір зразків крові та тканин

Виділення МВМ трофобластів

Протокол виділення MVM трофобластів із плаценти миші був адаптований до протоколу, який раніше використовувався в плаценті людини (16). Всі процедури проводили на льоду, а етапи центрифугування проводили при 4 ° C. Гомогенати центрифугували при 10000 g протягом 15 хв; гранули ресуспендували, повторно гомогенізували в 1 мл буфера D і центрифугували при 10000 g протягом 10 хв. Одержані супернатанти об'єднували і пряли при 125000 g протягом 30 хв. Гранульовану неочищену мембранну фракцію ресуспендували в 2 мл буфера D і додавали 12 мМ MgCl2. Суспензію перемішували протягом 20 хв на льоду. Після центрифугування при 2500 g протягом 10 хв супернатант центрифугували при 125000 g протягом 30 хв. Кінцеву гранулу ресуспендували в буфері D, отримуючи концентрацію білка ~ 10 мг/мл. Чистоту MVM оцінювали шляхом збагачення MVM/гомогенатом лужної фосфатази (23) і виявили, що вона становить 13 ± 1,49 рази (n = 16).

Вестерн-блот

Тест на толерантність до глюкози

Тести на толерантність до глюкози проводили у підгрупи мишей на Е18.5 після 6-годинного голодування. Свідомим нестримним мишам вводили внутрішньовенно. з глюкозою (2 г/кг маси тіла), а кров відбирали у трьох примірниках з хвостової вени через 0, 15, 30, 60 та 90 хв після навантаження глюкозою. Кров отримували шляхом ампутації кінчика хвоста в нульовий момент часу та видаленням раневої кірки в наступні моменти часу. Глюкозу в крові негайно вимірювали за допомогою глюкометра Freestyle (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA).

Дослідження транспорту плаценти in vivo

На Е18,5 дамби знеболювали за допомогою Ketaset (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, USA) та інактину (Sigma-Aldrich Corp.), був зроблений розріз шиї, а яремну вену було виявлено та катетеризовано. Болюс двох радіоактивно мічених індикаторів (50 мкКі/кг [14 С] метиламіноізомасляної кислоти (MeAIB) та 250 мкКі/кг [3 Н] метилглюкози; Перкін Елмер, Уолтем, штат Массачусетс, США) вводили у яремну вену. Через 3 хв дамба була принесена в жертву при передозуванні інактину, зразок артеріальної крові матері був отриманий шляхом серцевої пункції, проведена лапаротомія, а плоди вбиті шляхом обезголовлення. Плоди та плаценти видаляли, зважували та розчиняли протягом 4 год у Biosol (National Diagnostics, Атланта, Джорджія, США). Радіоактивність у материнській плазмі та солюбілізованих плацентах та плодах визначали шляхом бета-підрахунку. Однонаправлений кліренс матерофеталу (Kmf; мкл · хв −1 · г −1) для кожного індикатора обчислювали наступним чином:

де Nx - кількість у плода, взята в момент x, коли мати була вбита (dpm), AUC0 – x - площа під кривою материнської концентрації ізотопу від часу до часу жертвоприношення матері (dpm · хв · мкл -1) (25), а W - маса вологи плаценти (г).

Презентація даних та статистика

Дані представлені як середнє значення ± se. Для даних щодо плоду та плаценти розраховували середнє значення для кожного посліду, і це середнє значення використовували для подальшого статистичного аналізу. Таким чином, n являє собою кількість послідів. Статистичну значимість відмінностей між групами C та HF оцінювали за допомогою непарного t-критерію Стьюдента. Для багатовимірного аналізу використовували кореляції Пірсона. P Таблиця 1). На рівні E18.5 дамби, що харчуються ВЧ, були на 12% важчі, ніж дамби, що годували дієту С; однак різниці у вазі матері після видалення плодів шляхом кесаревого розтину не було (табл. 1). Загальна вага материнських жирових прокладок була збільшена на 7% у тварин, які харчувались ВЧ-дієтою (табл. 1). При рівні Е18,5 материнські рівні адипонектину знижувались на 35% у дамках, що годували ВЧ, а рівні лептину значно збільшувались на> 80% у тварин, які харчувались ВЧ-дієтою (Таблиця 1). Ніяких відмінностей у рівні IL-6 у матері не спостерігалось (табл. 1), а рівні TNF-α були нижчими за рівень виявлення у всіх тварин. Материнський HbA1c (таблиця 1) та рівень глюкози в крові натще ( Рис. 1 ) були подібними в обох групах, що вказує на те, що у тварин, що харчуються ВЧ, не розвивався діабет. Рівень інсуліну, що не дотримувався матері, на рівні Е18,5 був подібним у двох групах дієти (табл. 1). Реакція глюкози в крові на внутрішньочеревне навантаження глюкозою була однаковою у контрольних та ВЧ-годуючих дамб (рис. 1) .

ТАБЛИЦЯ 1.

Вага матері та метаболічні параметри при Е18,5

ПараметрC дієтаHF дієта Значення a
Щоденне споживання калорій (ккал)14,82 ± 0,2516,76 ± 0,21П се. Дієти C і HF годували самками мишей 8 тижнів до і протягом гестації. Всі вимірювання сироватки були неточними. статистичну значимість визначали за допомогою неспареного t-критерію Стьюдента; P se; n = 5/дієта. Дієти C (○) та СН (▪) давали самкам мишей 8 тижнів до і протягом гестації. I.p. Була проведена ін’єкція 2 г/кг 30% розчину глюкози, а також показані вимірювання рівня глюкози в крові з хвостової вени в моменти часу. Істотної різниці між двома групами дієт не виявлено.

Вага плоду, плаценти та загальної посліду при E18,5. Значення - це середнє значення ± se. Дієти C та HF давали самкам мишей 8 тижнів до і протягом гестації. P 3 H] метилглюкоза та [14 C] MeAIB у відповідь на ВЧ дієту ( Рис.3 ). Однонаправлений матерофетальний кліренс [3 H] метилглюкози був збільшений в 5 разів, а кліренс [14 C] MeAIB - у 10 разів у HF-групі порівняно з C-групою. Збільшення швидкості кліренсу плаценти було пов’язане зі значним збільшенням експресії GLUT1 (у 5 разів) у ізольованих плацентарних MVM від тварин, які харчувались ВЧ-дієтою ( Рис. 4 і та5). 5 ). Крім того, експресія білка SNAT2 значно збільшилась (у 9 разів) у MVM від тварин, які харчувались високочастотною дієтою (рис. 4 та та 5). 5). Навпаки, експресія білка MVM SNAT4 не впливала на ВЧ-дієту (рис. 4). Експресію GLUT3 вимірювали в загальному гомогенаті плаценти; однак різниці між двома групами дієт не виявлено (рис. 5) .