Дієта, багата білком тварин, сприяє протизапальній реакції макрофагів і посилює коліт у мишей

Клара Костовчикова

1 Лабораторія клітинної та молекулярної імунології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

дієта

2 Лабораторія клітинної біології та розвитку, Інститут молекулярної генетики CAS, v.v.i., Прага, Чехія

Степан Куфал

1 Лабораторія клітинної та молекулярної імунології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

Наталі Галанової

1 Лабораторія клітинної та молекулярної імунології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

Олена Файстова

1 Лабораторія клітинної та молекулярної імунології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

Томаш Гудковіч

3 Лабораторія гнотобіології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Новий Градек, Чехія

Мартін Костовчик

4 Лабораторія грибкової генетики та метаболізму, Інститут мікробіології КАС, v.v.i., Прага, Чехія

Петра Прочазкова

1 Лабораторія клітинної та молекулярної імунології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

Зузана Іраскова Закостельська

1 Лабораторія клітинної та молекулярної імунології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

Мартина Чермакова

5 Лабораторія характеристики молекулярної структури, Інститут мікробіології КАС, v.v.i., Прага, Чехія

Бланка Седіва

5 Лабораторія характеристик молекулярної структури, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

6 Факультет прикладних наук Університету Західної Богемії, Пльзень, Чехія

Марек Кузьма

5 Лабораторія характеристики молекулярної структури, Інститут мікробіології КАС, v.v.i., Прага, Чехія

Олена Класкалова-Хогенова

1 Лабораторія клітинної та молекулярної імунології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

Мілослав Кверка

1 Лабораторія клітинної та молекулярної імунології, Інститут мікробіології CAS, v.v.i., Прага, Чехія

7 Кафедра фармакології, Інститут експериментальної медицини CAS, v.v.i., Прага, Чехія

Пов’язані дані

Анотація

Вступ

Мікробіота кишок комменсалу суттєво впливає на метаболізм господаря. Його катаболічні та анаболічні шляхи дозволяють використовувати широкий спектр субстратів, включаючи всередину, речовини, що виділяються в просвіт кишечника, або ті, що безпосередньо виробляються (іншими) мікробами (1). З цих джерел дієта становить основну масу, і оскільки на неї найпростіше впливати, найбільше уваги привертає дієтичне втручання мікробіоти та здоров’я. Зміни в раціоні спонукають мікроби адаптуватися до нового субстрату, таким чином, спричиняючи глибокі зміни мікробіоти, які можуть поліпшити здатність господаря пристосовуватися до навколишнього середовища. Зміни, спричинені екстремальними дієтами, можуть зберігатися протягом тривалого часу і, таким чином, відображати раціон харчування господаря (2). Ці адаптаційні зміни схожі на різні лінії ссавців та мають важливе значення для здоров'я господаря (3). Дієтичні втручання також можуть спричинити швидкі та відтворювані зміни мікробіоти та збагатити громаду тимчасовими мікробами, що переносяться їжею, які не здатні до тривалої колонізації (4). Справді,

15% мікробних оперативних таксономічних одиниць (ОТУ) демонструють сильні добові коливання через час прийому їжі, тим самим синхронізуючи циркадні годинники до рівня обмінних процесів. Цікаво, що тривале порушення цієї тонко налаштованої системи у вахтових працівників та частих пасажирів може спричинити тимчасовий дисбіоз із серйозними метаболічними наслідками (5).

Порушення мікробіоти кишечника, тобто дисбактеріоз, нещодавно пов’язане з патогенезом запальних захворювань кишечника (ВЗК) (6), метаболічним синдромом (7, 8), серцево-судинними захворюваннями (9), неврологічними розладами (10) і навіть раком ( 11). Зростає кількість доказів того, що дієтичні макроелементи можуть як сприяти, так і протидіяти дисбіозу та його наслідкам (12). Як короткочасні, так і довгострокові дієтичні втручання призводять до суттєвих змін мікробіоти кишечника і можуть впливати на прозапальний статус слизової оболонки кишечника (13, 14). Існує загальновизнаний зв’язок між дієтою та ВЗК. Ретроспективні дослідження показали, що велике споживання сахарози, червоного м’яса або маргарину збільшує відносний ризик розвитку ВЗК, споживання злакових, фруктово-овочевих або багатих клітковиною продуктів загалом зменшує (15–18).

Збільшення дієтичного споживання білків тваринного походження пропонується як фактор, що сприяє розвитку хвороби Крона вже кілька десятиліть тому (19, 20). Метаболізм білків в основному відбувається в дистальній частині товстої кишки, де джерела вуглеводів зменшуються, і бактерії можуть перевести свій метаболізм на асахаролітичний. Залежно від джерела білка, тваринні та молочні білки майже повністю розкладаються під час проходження, тоді як рослинні білки менш розкладаються і у більшій кількості досягають товстої кишки (21). Деградація білків, пептидів та амінокислот призводить до утворення різних біологічно активних метаболітів, таких як розгалужені ланцюги жирних кислот, амонію, сірководню, р-крезолу, фенольних та індольних похідних, які можуть впливати на життєздатність та проліферацію епітеліальних клітин, таким чином впливає на функцію бар'єру кишечника та імунну відповідь. Деякі з цих видів діяльності пов’язані з патогенезом ВЗК та інших шлунково-кишкових захворювань (22).

У кількох дослідженнях проаналізовано вплив дієти, багатої на білки (HPD), на фізіологію шлунково-кишкового тракту та основну епітеліальну відповідь. Щури, які споживали HPD, мали різний склад мікробіоти та метаболічну активність, змінювали морфологію колоноцитів та ферментативні шляхи, більше келихоподібних клітин та збільшували вироблення муцину порівняно з щурами, які споживали нормопротеїдну дієту (23–25). Індукція експериментального запалення у мишей, яких годували HPD, призвела до важкого коліту з високою смертністю (26). Нещодавно дослідження з аналізу джерела та кількості макроелементів виявило, що велика кількість дієтичного казеїну найбільш суттєво сприяє чутливості до коліту, тоді як чутливість клітковини псилію зменшується. В обох цих випадках склад мікробіоти, а також функції щільності та кишкового бар'єру були основними механізмами, що задіяні (27). У сукупності ці дослідження показали, що різні дієтичні білки можуть змінювати реакцію господаря на мікробіоти кишечника, включаючи точну настройку імунної системи слизової і, зрештою, впливати на сприйнятливість до експериментального коліту.

Продукти метаболізму мікробіоти кишечника (такі як коротколанцюгові жирні кислоти, SCFA) впливають на дозрівання та активність Т-клітин і можуть регулювати імунну систему господаря як безпосередньо, так і опосередковано через інші клітини (28, 29). Приєднуючись до епітелію кишечника, мікроби можуть регулювати баланс у відповіді Т-клітин кишечника. Залежно від конкретного мікроба, вони можуть індукувати або регуляторні Т-клітини, або прозапальні клітини Th17 (30, 31). У будь-якому випадку мононуклеарні клітини слизової оболонки кишечника відіграють вирішальну роль у імунній відповіді слизової оболонки та чутливості до запалення кишечника. Насправді, одноядерні клітини, такі як макрофаги, що мешкають у слизовій оболонці кишечника, сприяють місцевій толерантності та незапальному середовищу, виробляючи IL-10 та PGE2 та не реагуючи на бактеріальний ліпополісахарид (32). Беручи до уваги, що моноцити крові Ly6C + набираються на слизову у відповідь на прозапальну стимуляцію; перевершуючи чисельність макрофагів і виробляючи велику кількість IL-1β і TNF-α (33, 34).

Метою цього дослідження було проаналізувати, як дієтичний білок може сприяти патогенезу ВЗК, з особливим акцентом на мікробні та імунологічні механізми з використанням двох наборів (на основі білків тваринного та рослинного походження) повністю синтетичних нормо- та гіперпротеїнових дієт. Гнотобіотичні експерименти були використані для розшифрування важливості взаємодії господаря-дієти та мікробіоти та її наслідків для гострого запалення кишечника.

Матеріали і методи

Тварини

Імунокомпетентні BALB/c та імунодефіцитні нокаутовані миші RAG2 на тлі BALB/c були отримані з племінної колонії Інституту фізіології КАС та Інституту мікробіології КАС відповідно, і всі експерименти проводились за будь-яким звичайні умови або умови, що не містять мікробів, в Інституті мікробіології КАС. Мишей годували підтримуючою дієтою для щурів та мишей № 1324 (Altromin Spezialfutter, GmbH & Co. KG, Німеччина), якщо не зазначено інше. Різні експериментальні групи розміщувались в окремих клітках. На додаток до цього, безмікробні миші утримувались у пластикових ізоляторах типу Трекслера в стерильних умовах, що забезпечувались стерильною водою протягом декількох поколінь до початку експериментів. Це дослідження було проведено відповідно до рекомендацій норм етики, визначених законодавством ЄС щодо використання експериментальних тварин (2010/63/ЄС) та чеським Законом про добробут тварин. Протокол затверджений Комітетом з догляду та використання тварин Інституту мікробіології (ідентифікаційний номер затвердження: 85/2015 та 108/2016).

Дієти та експериментальний дизайн

У більшості експериментів, незабаром після відлучення, мишей переводили або на дієту на основі тваринних білків - контроль (aCD, 176 г/кг сирого білка; Cat # C1000) і високобілкову дієту (aHPD, 514 г/кг сирого білка; Cat # C1001) або дієта на основі рослинних білків - контроль (pCD, 173 г/кг сирого білка; Cat # C 1000/110007) та дієта з високим вмістом білка (pHPD, 500 г/кг сирого білка; Cat # C1001/1001127; все від Altromin Spezialfutter, GmbH & Co. KG). Всі ці дієти готували синтетично, містячи або казеїн (тварина), або клейковину пшениці (рослина) як джерело білка (табл. 1). Мишей тримали на цих дієтах протягом 3 тижнів до початку експерименту, а потім протягом усього експерименту. У деяких експериментах довготривалий ефект дієти аналізували, перемикаючи дієту вже на батьківське покоління мишей. Ми виміряли проникність кишечника для макромолекул у здорових мишей, яких годували різними дієтами. З цією метою ми обробляли мишей перорально 440 мг/кг маси тіла міченої FITC молекули 3-5 кД декстрану (Merck, Cat # FD4) та вимірювали флуоресценцію сироватки через 4 години, як ми вже опублікували раніше (35).

Таблиця 1

Склад експериментальних дієт.

aCDaHPDpCDpHPD
Білок [г/кг]176.115514.115172,685500.440
Жир [г/кг]50,83051.03070,93770,002
Клітковина [г/кг]40.45039.37030.35830.490
Зола [г/кг]54,94363,34353.10051.522
Вологість [г/кг]81,73677,73676,87471.076
Моно та дисахариди [г/кг]110,960110,960110,65056,806
Полісахариди [г/кг]471 700115 700422,425116.147
Енергія [ккал/кг]3518,0553458.0553641,5663669 700

Гострий та хронічний експериментальний коліт

Хронічний коліт DSS викликався трьома циклами, що складалися з 5 днів DSS та 9 днів водопровідної води. Аналізи тяжкості коліту за ДАІ, укорочення товстої кишки та пошкодження слизової проводили, як описано вище. Рівень білка гаптоглобіну гострої фази визначали у сироватці миші, використовуючи мишачий гаптоглобін ELISA Duoset (Bio-Techne, Міннеаполіс, Міннесота, США; Cat # DY4409).

Виснаження макрофагів in vivo

За два дні до лікування DSS мишам інтраперитонеально вводили 200 мкл порожніх ліпосом або ліпосом, завантажених клодронатом (Liposoma BV, Амстердам, Нідерланди; Cat # CP-010-010) для виснаження моноцитів крові та, можливо, деяких тканинних макрофагів у селезінка та товста кишка (38). Щоб підтримувати та сприяти виснаженню протягом усього періоду лікування DSS, ми вводили мишей кожні 3 дні, починаючи за 2 дні до введення DSS (день -2, день 1 та день 4).

Культури клітин тканин та вимірювання цитокінів

Тканину товстої кишки культивували ex vivo, як описано раніше (37). Коротко, три міліметрову ударну біопсію з дистальних відділів товстої кишки було зібрано, зважено та культивовано у 500 мкл повної середовища RPMI (Merck; Cat # R0883), що містить 10% інактивованої фетальної бичачої сироватки (Biochrom GmbH, Німеччина; Cat # S 0115) та 1% антибіотико-антимікотичний розчин (Merck) у зволоженому інкубаторі (37 ° C, 5% CO2) протягом 48 годин. Супернатанти збирали і зберігали при -20 ° C до аналізу. Цитокіни вимірювали в супернатантах культури тканин, використовуючи відповідні набори ІФА (Bio-Techne; Cat # DY410, DY406, DY401 та DY3626) відповідно до інструкцій виробника.

Підготовка клітин та аналіз проточної цитометрії

Одноклітинні суспензії з мезентеріальних лімфатичних вузлів (мл) і селезінки готували механічним руйнуванням і пропускали через сито для клітин 70 мкм (Becton Dickinson; Cat # 352350). Після промивання (300 × g, 5 хв, 4 ° C) еритроцити селезінки лізували 5-хвилинною інкубацією в буфері для лізингу еритроцитів (1 мМ EDTA, 150 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3). Надосадову рідину з лізованими еритроцитами видаляли і клітини використовували для подальшого аналізу. Одноклітинні суспензії з товстої кишки готували, використовуючи опублікований протокол (39). Далі клітини блокували звичайною мишачою сироваткою та інкубували з кон’югованими фторхромом антитілами, що розпізнають позаклітинні епітопи (Додаткова таблиця 1). Потім клітини обробляли набором буферного забарвлення eBioscience ™ Foxp3/Transcription Factor Factor (Thermo Fisher Scientific; Cat # 00-5523-00) і фарбували на внутрішньоклітинні антигени (Додаткова таблиця 1). Щоб розрізнити життєздатні та мертві клітини, фарбувальну суміш, що фіксує - eFluor 780 (Thermo Fisher Scientific; Cat # 65-0865-18), додали до фарбувальної суміші перед фіксацією. Дані отримували шляхом вимірювання зразків на LSRII (BD Biosciences, CA), а для аналізу даних використовували програмне забезпечення FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR; RRID: SCR_008520). Приклад використаної стратегії воріт показаний на додатковому малюнку 7.

ПЛР у режимі реального часу

Аналіз мікробіоти кишечника

Метаболоміка мікробіоти кишечника

На 0 день одна фекальна гранула

По 25 мг від кожної миші збирали та гомогенізували за допомогою енергійного вихрового перемішування в 500 мкл забуференного фосфатом сольового розчину (PBS; рН = 7,4). Далі зразок центрифугували (13000 × g протягом 10 хв) для видалення твердих частинок, а супернатант переносили в свіжу пробірку для мікрофугування і знову центрифугували. Отриманий супернатант ліофілізували при -58 ° C протягом ночі, повторно суспендували в D2O (500 мкл), що містить 0,01% триметилсилилпропіонової кислоти як внутрішній стандарт, і переносили в 5-мм ЯМР-пробірку. ЯМР-спектри реєстрували на 600 МГц спектрометрі Bruker Avance III (Bruker BioSpin, Рейнштеттен, Німеччина), оснащеному 5-мм криогенною головкою зонда TCI. Більш детальний опис експериментальних умов ЯМР-аналізу та відповідних етапів обробки наведено в Додатковій інформації. Загальний вміст білка у фільтратах фекальних гранул вимірювали за допомогою аналізу біцинхонінової кислоти (BCA) (Pierce ™ BCA Protein Assay Kit; ThermoFisher Scientific; Cat # 23227) відповідно до рекомендацій виробника.

Статистичний аналіз

Для порівняння кількох експериментальних груп був використаний односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) з тестом багаторазового порівняння Тукі. Двосторонній ANOVA з Бонфероні після тесту був використаний для визначення значущих змін ваги та DAI. Відмінності між двома групами оцінювали за допомогою непарного двостороннього t-критерію Стьюдента. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, а різниці вважалися статистично значущими при P ≤ 0,05. Для аналізу було використано статистичне програмне забезпечення GraphPad Prism (версія 5.0, Програмне забезпечення GraphPad, RRID: SCR_002798).

Результати

Багата білками дієта тваринного походження погіршує гострий коліт, тоді як багата білками дієта рослинного походження ні