BRI2 (ITM2b) інгібує осадження β у природних умовах

Чжунсу Кім

Кафедри 1 Неврології та

Віктор М. Міллер

Кафедри 1 Неврології та

Йона Левітес

Кафедри 1 Неврології та

Карен Янсен Вест

Кафедри 1 Неврології та

Крейг В. Цвізінський

Кафедри 1 Неврології та

Бренда Д. Мур

Кафедри 1 Неврології та

Фредрік Дж. Трондл

Кафедри 1 Неврології та

Маралісса Бан

Кафедри 1 Неврології та

Крістоф Вербек

Кафедри 1 Неврології та

Роберт В. Прайс

Кафедри 1 Неврології та

Ліза Смітсон

Кафедри 1 Неврології та

Лейлані Сонода

Кафедри 1 Неврології та

Кейлі Вагг

Кафедри 1 Неврології та

Віджаярагаван Рангачарі

Кафедри 1 Неврології та

Фангген Цзоу

Кафедри 1 Неврології та

Стівен Г. Юнкін

Кафедри 1 Неврології та

Ніл Графф-Редфорд

2 Неврологія, Медичний коледж клініки Майо, клініка Майо Джексонвілл, Джексонвілл, Флорида 32224

Денніс Діксон

Кафедри 1 Неврології та

Террон Розенберрі

Кафедри 1 Неврології та

Тодд Е. Голде

Кафедри 1 Неврології та

Анотація

Аналіз біологічних ефектів мутацій у генах BRI2 (ITM2b) та білку-попередника амілоїду β (APP) підтверджує гіпотезу про те, що мозкове накопичення амілоїдогенних пептидів у сімейних британських та сімейних данських деменціях та хвороба Альцгеймера (AD) пов'язана з нейродегенерацією. Ми використовували соматичну трансгенну технологію мозку для експресії трансгенів BRI2 та BRI2-Aβ1–40 у моделях мишей APP. Експресія BRI2-Aβ1-40 імітує супресивний ефект, який раніше спостерігався із застосуванням звичайних трансгенних методів, додатково підтверджуючи соматичну методологію трансгенного мозку. Несподівано ми також виявили, що експресія людського BRI2 дикого типу зменшує відкладення мозкового Aβ на моделі миші AD. Додаткові дані вказують на те, що пептид 23aa, Bri23, виділений з BRI2 звичайною обробкою, присутній у лікворі CSF, інгібує агрегацію Aβ in vitro та опосередковує його антиамілоїдогенну дію in vivo. Ці дослідження демонструють, що BRI2 є новим медіатором відкладення Aβ in vivo.

Вступ

Матеріали і методи

Конструкція та підготовка rAAV1.

rAAV1, що експресує BRI2, BRI2-Aβ1–40, BRI2del244–266, неспецифічний одноланцюговий змінний фрагмент (scFv ns) або посилений зелений флуоресцентний білок (eGFP) під контролем промотору цитомегаловірусу/куриного β-актину (CBA). генерується кальцієво-фосфатною трансфекцією pAM/CBA-pI-WPRE-BGH, цис-плазміди rAAV1 pH21 (допоміжна плазміда AAV1) та pFΔ6 у клітинну лінію HEK293. Про конструкцію rAAV1-scFv ns повідомлялося раніше (Levites et al., 2006b). Через 48 год після трансфекції клітини лізували у присутності 0,5% дезоксихолату натрію та 50 ОД/мл бензонази (Sigma) шляхом повторних раундів заморожування/відтавання при -80 ° C та -20 ° C. Вірус виділяли з використанням розривного градієнта йодиксанолу, а потім спорідненість очищали на колоні HiTrap HQ (GE Healthcare). Зразки елюювали з колонки і буфер обмінювали на PBS за допомогою пристрою для центрифугування Amicon Ultra 100 (Millipore). Геномний титр кожного вірусу визначали за допомогою кількісної ПЛР з використанням ABI 7900 (Applied Biosystems). Зразки вірусної ДНК готували шляхом обробки вірусу ДНКазою I (Invitrogen), нагріванням інактивуючи фермент, а потім перетравлюючи білкову оболонку протеїназою K (Invitrogen) з подальшою другою тепловою інактивацією. Зразки порівнювали зі стандартною кривою перевитої плазміди.

Ін’єкція rAAV1 новонародженим мишам.

Кількісне визначення осадження амілоїдів.

Напівмозги занурення закріплювали у 10% формаліні, потім обробляли для вкладання парафіну. Зрізи тканини мозку (5 мкм) були імунофарбовані анти-тотальним Aβ антитілом [33.1.1; 1: 1000 (Levites et al., 2006a)] на автостайнері DAKO. Кількісне навантаження на бляшки Aβ та кількість S-позитивних бляшок на Тіо визначали кількісно, як повідомлялося раніше (Kim et al., 2007). Було проаналізовано від трьох до шести сагітальних зрізів на мозок з відстанню 50 мкм.

Aβ сендвіч ІФА.

Для ІФ-аналізу мозку Aβ від мишей TgCRND8 гемі-передній мозок гомогенізували у 2% SDS із 1 × сумішшю інгібіторів протеази (Roche), розчиненою у H2O, а потім ультрацентрифугували при 100000 × g протягом 1 години. Нерозчинні у SDS пептиди Aβ екстрагували із застосуванням 70% мурашиної кислоти (FA). Для ІФ-аналізу мозку Aβ від 2-місячних мишей Tg2576 гемі-передній мозок гомогенізували в буфері для аналізу радіоімунопреципітації (0,1% SDS, 0,5% дезоксихолату, 1% Triton X-100, 150 мм NaCl і 50 мм Tris-HCl) та потім ультрацентрифугували при 100000 × g протягом 1 год. Для вимірювання рівня ендогенного мишачого рівня Aβ гемі-передній мозок нетрансгенних послідів мишей TgCRND8, що експресують BRI2, гомогенізували в 0,2% діетиламіновому буфері, що містить 50 м NaCl та 1 × суміш інгібіторів протеази (Roche). Рівні ендогенних мишей Aβ вимірювали за допомогою попередньо затвердженої специфічної для гризунів системи Aβ ELISA, як повідомлялося раніше (Eckman et al., 2006). Для аналізу Aβ плазми крові збирали в пробірки, покриті EDTA, після серцевої пункції. Зразки крові центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв при 4 ° C, а потім плазму аликвотували і зберігали при -80 ° C до використання. Рівні Aβ визначали за допомогою специфічних для кінцевих аналізів ІФА аналізів на кінці Aβ, як описано раніше (Kim et al., 2007).

Мишачий анти-Aβ IgG ІФА.

Щоб перевірити, чи генерують миші відповіді на антитіла до Аβ, титри антитіл до Аβ IgG визначали стандартними методами ІФА, як описано раніше (Das et al., 2001). Коротко, мікропланшетні планшети (Maxi Sorp; Dynatech) покривали агрегованим Aβ42 при 2 мкг/лунку. Після промивання додавали послідовні розведення плазми (розведення 1: 500) та інкубували протягом ночі при 4 ° C. Після змивів PBS/0,1% Tween 20 плазмовий IgG виявляли за допомогою анти-мишачого IgG-антитіла, кон'югованого з HRP (1: 2000; Sigma) та субстратом TMB (KPL).

Вестерн-блот.

Заморожені зразки переднього мозку гомогенізували в 2% SDS-буфері з 1 × сумішшю інгібіторів протеази (Roche). Гомогенат центрифугували при 100000 × g протягом 1 години при 4 ° С. Концентрацію білка в супернатантах визначали за допомогою набору BCA Protein Assay Kit (Pierce). Зразки білка (20 мкг) запускали на гелях Bis-Tris 12% XT (Bio-Rad) з буфером XT-MES або гелях Bis-Tris 4–12% XT (Bio-Rad) з буфером XT-MOPS і переносили на 0,2 мкм мембрани нітроцелюлози. Плямки мікрохвилювали протягом 2 хв у 0,1 м PBS двічі і зондували антитілом 82E1 (анти-Aβ1-16; 1: 1000; IBL), CT20 (анти-APP С-кінцевий 20 аа; 1: 1000; TE Golde) і ITM2b (GenWay). Плямки видаляли і зондували анти-β-актином (1: 1000; Sigma) в якості контролю завантаження. Відносну інтенсивність смуги визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення ImageJ (NIH).

Аналіз агрегації A in vitro з використанням нативного гель-електрофорезу.

Синтетичні Aβ1–42 і Aβ1–40, оброблені гексафторізопропанолом і висушені (Bachem), і пептиди Bri2–23 (Bachem) розчиняли в ДМСО, а потім розбавляли в TBS при молярних співвідношеннях, як зазначено. Суміші пептидів Aβ1–42 та Bri2–23 інкубували протягом 3 годин при 0 ° C або 37 ° C без струшування. Суміші обробляли на 4–20% гелях Tris-HCl в неденатураційних умовах і переносили на 0,4 мкм мембрану з полівініліденфторидом, як описано раніше (Klug et al., 2003; Kim et al., 2007). Блот зондували Ab9 (анти-Aβ1-16; 1: 1000; Т. Е. Голде). Відносну інтенсивність смуги визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення ImageJ (NIH).

Аналіз агрегації Aβ1–42 in vitro з використанням досліджень тіофлавіну Т та атомно-силової мікроскопії.

Пептиди Bri2–23 (Bachem) були відновлені в 1 мг/мл трис-HCl, рН 8,0. Ліофілізований синтетичний Aβ1–42 (установа для синтезу пептидів Mayo Clinic) розчиняли на 0,5–2,0 м м у 20 м NaOH за 15 хв до ексклюзивної хроматографії на колонці Superdex 75 HR 10/30 (GE Healthcare) для видалення будь-яких попередньо сформованих агрегатів β. Концентрацію мономерного Aβ визначали за поглинанням УФ з розрахунковим коефіцієнтом екстинкції 1450 см -1 × м -1 при 276 нм (Rangachari et al., 2006). Реакції агрегації Aβ1–42 ініціювали в силіконізованих пробірках Еппендорфа шляхом інкубації 25–50 мкм свіжоочищеного мономеру Aβ1–42 у 10 м м Tris-HCl та 150 м м NaCl, рН 8,0, буфер без перемішування при 37 ° C. Мономерний процес агрегації Aβ1–42 у присутності або відсутності пептиду Bri2–23 контролювали за допомогою аналізу на тіофлавін Т (ThT), як повідомлялося раніше (Rangachari et al., 2006). Зображення з атомно-силовою мікроскопією отримували за допомогою контролера NanoScope III з багатомодовим AFM (Veeco Instruments), як описано раніше (Nichols et al., 2005). Зображення відображаються в амплітудному режимі, де збільшення яскравості вказує на більшу амортизацію консольних коливань.

ВЕРХ/мас-спектрометричний аналіз пептидів Bri2–23.

Кондиціонований носій або лікворна рідина фільтрували через шприцевий фільтр 0,45 мкм для видалення великих твердих частинок. Аліквоту 50 мкл зразка вводили у ВЕРХ Agilent серії 1100 із колоною Zobax Eclipse XDB-C8 та пусковим буфером ацетонітрилу/H2O (ACN: H2O) з 0,1% трифтороцтовою кислотою (TFA) зі швидкістю потоку 1 мл /хв. Початковий склад розчинника становив 20:80 ACN/H2O; цю композицію витримували протягом 3 хв, а потім лінійно нарощували до 37:63 ACN/H2O протягом наступних 7 хв. Фракцію збирали між 9,4 і 10,4 хв (оскільки, як було видно, стандарт BRI-23 елююється через 9,8 хв), загалом 1 мл.

Потім зібрану фракцію продували азотом при 37 ° C до ~ 100 мкл в обсязі. Аликвоту 1 мкл цієї концентрованої проби наносили на мікросхему золотого масиву Bio-Rad і давали їй висохнути на повітрі. Після висушування зразків 1 мкл насиченої α-ціано-4-гідроксикоричної кислоти (матриця MALDI) в 70:20:10 ACN: H2O: MeOH з 0,1% TFA наносили поверх висушеного зразка і залишали на повітрі висохнути. Потім це було проаналізовано на системі часу польоту Bio-Rad Ciphergen ProteinChip SELDI. Інтенсивність лазера 750 мкДж була використана для збору спектрів з 3975 лазерних знімків, які були усереднені в кінцеві спектри. Готові спектри були скориговані на базовому рівні.

Статистичний аналіз.

Для статистичного порівняння (версія SigmaStat 3.0) використовували односторонній ANOVA з пост-тестовим тестом багаторазового порівняння Holm-Sidak або двостороннім тестом Стьюдента. Якщо дані не відповідали припущенням для параметричного тесту, проводили непараметричну статистику, або тест Крускала – Уолліса (односторонній ANOVA по рангах), за яким послідовно проводили процедури багаторазового порівняння Данна, або тест суми за рангом Манна – Уїтні (версія SigmaStat 3.0) . Мінливість оцінок повідомлялася як SEM.

Результати

BRI2 та BRI2-Aβ1–40 пригнічують відкладення амілоїду у трансгенних мишей APP

Ефекти вірусу доставленого трансгену BRI2-Aβ1–40 порівнювали з ефектами трансгену BRI2 людини, що доставлявся rAAV1, та неін’єкційного контролю (рис. 1 Б). Експресія BRI2 повинна була стати другим контролем, оскільки ми встановили, що доставка rAAV1-hGFP та фальшива доставка вірусу не змінюють відкладення Aβ у моделі миші CRND8 APP (Levites et al., 2006b). Через три місяці після доставки трансгену, опосередкованого rAAV1, мишей вбивали та відкладали Aβ в мозку, використовуючи як біохімічні, так і гістохімічні методи. Ці аналізи виявили значний супресивний ефект як трансгенів BRI2-Aβ1–40, так і BRI2 на накопичення паренхіматозних Aβ1–40 і Aβ1–42, виміряних біохімічними та гістохімічними оцінками рівнів Aβ (рис. 1 C – E).

Bri2–23 пригнічує агрегацію Aβ1–42 in vitro

Пептид Bri2–23 пригнічує агрегацію Aβ in vitro. A, Синтетичні пептиди Aβ1–42, Aβ1–40 та Bri2–23 змішували у вказаних концентраціях та інкубували при 0 або 37 ° C протягом 3 годин. Після інкубації ступінь агрегації Aβ в агрегати HMW оцінювали за допомогою нативного гель-електрофорезу та вестерн-блот з антитілом Ab9 (анти-Aβ1-16), яке розпізнає фібрили Aβ, олігомери та мономери. B, Кількісний аналіз другого дослідження доза-реакція показав різницю в мономерних рівнях Aβ1-42 між інкубаціями від 37 до 0 ° C. n = 3 для кожної умови. * p m агрегація Aβ42 (ANOVA). C., Мономерний Aβ1–42, виділений методом ексклюзивної хроматографії, інкубували у присутності або відсутності пептиду Bri2–23. У зазначений час аликвоти реакційних сумішей агрегації аналізували на ступінь агрегації методом ThT. D, AFM-аналіз агрегатів через 72 год інкубації. Репрезентативні зображення, показані у режимі висоти, мають розмір 10 × 10 мкм. Шкали шкали, 1 мкм.

Послідовність Bri2–23 необхідна для придушення відкладення Aβ in vivo

Ці спостереження припустили, що антиамілоїдогенна дія білка BRI2 опосередковується взаємодією між Bri2–23 та Aβ. Для подальшого тестування цієї ідеї in vivo ми створили кДНК, яка експресує усічений білок BRI2, у якому відсутній пептид Bri2–23 (BRI2del244–266) (рис. 4 А), і використовували передачу гена rAAV для доставки цієї конструкції новонародженим мишам TgCRND8. Трансгенних позитивних мишей вбивали у віці 3 місяців та досліджували біохімічні та гістохімічні навантаження на Аβ. Аналіз навантажень β не показав суттєвої різниці між BRI2del244–266 та контрольними групами (рис. 4 B – D). Вестерн-блот-аналіз лізатів мозку продемонстрував, що соматична трансгенна методологія мозку давала приблизно еквівалентні рівні експресії з конструкцій BRI2 та BRI2del244–266 та дещо вищі рівні з BRI2-Aβ1–40 (рис. 4 E). Ці пізніші дані та відсутність антиамілоїдогенного ефекту від BRI2del244-266 демонструють, що послідовність пептидів Bri2-23 є критично важливою для інгібуючого ефекту BRI2 in vivo. Разом з даними, що демонструють, що Bri2–23 безпосередньо інгібує агрегацію Aβ in vitro, ці дані підтримують антиамілоїдогенну функцію BRI2, опосередковану пептидом Bri2–23.

Пептид Bri2–23 присутній в лікворі людини

Дані наших мишей припустили, що ендогенний BRI2 може функціонувати, принаймні частково, шляхом секреції пептиду Bri2–23 як антиамілоїдогенного партнера, що зв’язує Aβ. На сьогодні дослідження нормальної обробки та секреції BRI2 спирались головним чином на мічені епітопом версії пептиду Bri2–23 (Kim et al., 1999; Choi et al., 2004). Антитіла першого покоління були недостатньо чутливими для виявлення пептиду Bri2–23 у біологічних зразках. Таким чином, ми розробили аналіз на основі ВЕРХ/мас-спектрометрії (ВЕРХ/МС) для виявлення секретованого Bri2–23. Ми перевірили цю методологію шляхом виявлення не позначеної секреції пептиду Bri2–23 із клітин H4, трансфікованих BRI2, але не BRIdel244–266 (рис. 4 F). Потім ми протестували нормальну ліквору людини та змогли виявити секретований ендогенно пептид Bri2–23 у всіх досліджених зразках (рис. 4 G). Цей висновок зміцнює уявлення про те, що антиагрегаційні ефекти пептиду Bri2–23 у наших експериментах можуть бути фізіологічно значущими для AD, FDD та FBD людини.

Обговорення

Ми використовували соматичну трансгенну технологію мозку для доставки трансгенів BRI2 та BRI2-Aβ1–40 до мозку моделей мишей APP. Дослідження з BRI2-Aβ1-40 підтвердили попередні дослідження, отримані з використанням звичайних трансгенних мишей, що експресують BRI2-Aβ1-40 (McGowan et al., 2005; Kim et al., 2007). Таким чином, трансгенні дослідження соматичного мозку BRI2-Aβ1–40 забезпечують додаткову перевірку цього швидкого економічно ефективного методу маніпулювання експресією генів у мозку (Levites et al., 2006b).

Подальше вивчення BRI2 та пептиду Bri2–23, а також аналогічних пептидів, вивільнених з гомологів BRI2 (які містять збережений мотив FxxxF), буде потрібно для повного розуміння їх антиамілоїдогенної дії та інших функцій. Потужний інгібуючий ефект BRI2 на осадження Aβ in vivo та агрегацію in vitro BRI2 вказує на те, що BRI2 є новим фактором, який модулює агрегацію та осадження Aβ. Ці дані підтверджують новий підхід до терапії та профілактики БА, заснований на підвищенні рівня BRI2 і, більш конкретно, пептиду Bri2–23 у мозку.