Дієта з високим вмістом жиру пов’язана з порушенням розвитку легенів плода

Рейна С. Мер

1 Центр легеневої та судинної біології та відділення неонатально-перинатальної медицини, кафедра педіатрії, Південно-західний медичний центр Техаського університету, Даллас, штат Техас;

Katelyn E. Finch

2 Центр діабету Touchstone, кафедра внутрішніх хвороб, Південно-західний медичний центр Техаського університету, Даллас, штат Техас; і

Джордан Зер

Євгенія Морзеллі

Майкл Д. Нейнаст

Аарон П. Франк

Ліза Д. Ханер

Джейсон Ван

3 Кафедра патології та педіатрії, Південно-західний медичний центр Техаського університету, Даллас, штат Техас

Дінеш Рахея

Біфф Ф. Палмер

Чарльз Р. Розенфельд

Рашмін С. Савані

Дебора Дж. Клег

Анотація

Харчування матері має глибокий довгостроковий вплив на здоров’я немовлят. Погане харчування матері впливає на розвиток плаценти та ріст плоду, що призводить до низької ваги при народженні, що сильно пов'язане з ризиком розвитку хронічних захворювань, включаючи хвороби серця, гіпертонію, астму та діабет 2 типу, в подальшому житті. Нечисленні дослідження окреслили механізми, за допомогою яких материнське харчування впливає на розвиток легенів плода. Тут ми повідомляємо, що вплив матері на дієту з високим вмістом жиру (HFD) спричинює запалення плаценти, що призводить до плацентарної недостатності, обмеження росту плода (FGR) та гальмування розвитку легенів плода. Слід зазначити, що до- та післяпологовий вплив HFD матері також призводить до стійкого спрощення альвеол у постнатальному періоді. Наші нові висновки забезпечують сильний зв'язок між материнською дієтою та розвитком легенів плода.

гіпотеза Баркера встановила, що в умовах внутрішньоутробного розвитку, таких як погане харчування матері, виникає обмежений ріст плода та поліорганні порушення (2, 5). Типова американська дієта - така, коли> 38% калорій отримують з жиру. Це прийняття дієт, багатих жиром, призвело до епідемії ожиріння у жінок дітородного віку. Важливо зазначити, що не встановлено, чи дієта матері, зокрема дієта з високим вмістом жиру (HFD), впливає на розвиток легенів плода. Є й інші харчові компоненти, які, як було показано, впливають на розвиток легенів плода (24, 36), але основна увага в цьому рукописі буде зосереджена на ВЧС матері. Легені плода особливо схильні до внутрішньоутробних образ (27). Наприклад, хоріоамніоніт (запалення плодових плацентарних оболонок) пов’язаний із зменшенням мікросудинного та альвеолярного розвитку в легенях плодових овець (22, 23). Вживання матір'ю HFD індукує ожиріння матері та призводить до стану системного запалення матері (3, 29). Однак незрозуміло, чи системне запалення матері викликає запальну реакцію в плаценті, змінюючи тим самим функцію плаценти, ріст плоду та розвиток легенів.

Дієти, багаті насиченими жирними кислотами, такі як пальмітинова кислота, пов’язані з посиленням запалення тканин шляхом безпосередньої активації вродженої імунної системи через Toll-подібні рецептори (34). Довічне споживання HFD призводить до підвищення маркерів запалення в кровообігу матері, таких як амілоїд сироватки крові A3 (SAA3), гострий фазовий білок-реагент (1, 29). Крім того, вплив плоду на ВЧС матері, незалежно від ожиріння матері та гіперінсулінемії, індукує запалення плаценти та збільшує частоту мертвонароджень у приматів нелюдей (15).

Функція плаценти є критично важливою для оптимального росту плода, а плацентарна недостатність є найпоширенішою причиною ФГР (16). FGR - це патологічне зменшення потенціалу росту плода (16). Це є основним ускладненням вагітності та збільшує ризик внутрішньоутробної та перинатальної захворюваності та смертності (27). Нещодавно було продемонстровано, що HFD матері призводить до зменшення внутрішньо-плацентарного кровотоку у приматів (15), а FGR пов'язаний зі структурними змінами та клітинною дисфункцією в легенях плода у овець (33).

Оскільки запалення плаценти та FGR незалежно пов'язані з аномаліями розвитку легенів (23, 27), ми охарактеризували вплив HFD матері на плаценту та розвиток легенів плода. Ми припустили, що HFD матері індукує запалення плода-плаценти, що призводить до FGR та гальмування розвитку легенів плода. Далі ми намагалися визначити механізм, за допомогою якого HFD матері пригнічує розвиток легенів плода. Враховуючи критичну роль стероїдів у розвитку легенів плода, ми оцінили вплив HFD матері на аспекти глюкокортикоїдного шляху в плаценті та легенях плода. Ми показуємо, що HFD матері пов'язаний із затримкою розвитку легенів плода, а також постнатальної альвеоларизацією, і що експресія глюкокортикоїдного рецептора (GR) знижується як в плаценті, так і в легенях плода. Це перше дослідження для визначення потенційного механізму, за допомогою якого HFD матері пригнічує розвиток легенів плода. Ці висновки критично важливі з огляду на зростання епідемії ожиріння.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Тварини.

Усі протоколи досліджень на тваринах були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Південно-західному медичному центрі Техаського університету (Юта). Мишей C57/Bl6 (віком 6–8 тижнів) було придбано в лабораторії Джексона. Усі миші були утримувані в середовищі з контрольованою температурою групами від двох до п’яти при 22–24 ° C, використовуючи 12: 12-годинний цикл світло-темрява з вільним доступом до води. Самці мишей мали вільний доступ до стандартного чау (№ 2916; Харлан-Теклад). Самки мишей (також віком 6–8 тижнів) поміщали або на HFD (42% калорій, отриманих з жиру, № 88137, n = 30; Харлан Теклад), або на звичайну чау (21,2% калорій, отриманих з жиру, № 2916, n = 25; Харлан-Теклад) протягом 3–5 міс до спарювання.

Спаровування тварин.

Самців та новонароджених самок спарювали протягом 36 годин та контролювали. Приріст ваги матері оцінювали щотижня. Вагітних самок вбивали в ембріональний день 18 (Е18) і збирали тканини.

Збір тканин.

Перед смертю вагітні самки голодували протягом 3 год. У разі смерті для оцінки концентрації глюкози та інсуліну натще збирали масу тіла матері та крові. Мишей вбивали, а плаценти збирали і зважували. Материнські та плодові частини плаценти відокремлювали та зберігали у RNAlater (Life Technologies) для аналізу РНК, швидко заморожували у рідкому азоті для аналізу білка або фіксували 4% параформальдегідом (PFA) для гістологічного аналізу. Кількість плоду було задокументовано та отримано ваги. Відношення плода до плаценти, яке є показником достатності плаценти, розраховували шляхом ділення маси плода на вагу плаценти. Праве та ліве легені розсікали за допомогою хірургічного розсікаючого мікроскопа та зважували. Праву легеню плода фіксували в 4% PFA для гістології або заморожували в рідкому азоті для аналізу білка. Леве легені плоду було збережено в РНК-пізніше для аналізу РНК.

Глюкоза натще у матері.

Сироватку відокремлювали від зразків цільної крові, а глюкозу натще визначали за допомогою набору глюкози крові натще (Millipore) відповідно до інструкцій виробника.

Інсулін натщесерце натощак.

Зразки сироватки аналізували за допомогою імуноферментних аналізів (ELISA) для оцінки концентрації інсуліну (Millipore) відповідно до інструкцій виробника.

Кількісна RT-PCR в режимі реального часу.

Плацентарну (з боку плода) та легеневі тканини плода вирізали і швидко помістили в RNAlater (Life Technologies). Загальну РНК екстрагували після гомогенізації тканин у Trizol (Invitrogen), використовуючи TissueLyser (Qiagen), а потім виділяли, використовуючи набір для екстракції RNeasy RNA (Qiagen) відповідно до інструкцій виробника. Кількість і якість РНК визначали за поглинанням при 260/280 нм. кДНК готували шляхом зворотної транскрипції 1,5 мкг РНК із застосуванням зворотної транскриптази SuperScript III (Invitrogen) та оліго (dT) (Invitrogen). Кількісні ПЛР в режимі реального часу проводили за допомогою праймерів TaqMan для Nlrp3 (Mm00840904_m1), IL-1β (Mm01336189_m1), GR (Mm00433832_m1), 11β-гідроксистероїддегідрогенази (HSD) 1 (Mm00476182_m1) M1 (SpA) (Mm00499170_m1), SpB (Mm00455678_m1), SpC (Mm00488144_m1), SpD (Mm00486060_m1) та β-актин (Mm00607939_s1) на системі виявлення послідовностей ABI Prism 7900 HT (Applied Bios duplicates. Відносні кількості всіх мРНК розраховували, використовуючи метод порівняльного порогового циклу. МРНК β-актину використовували як еталонний ген.

Аналіз білка.

Гістологія.

Легеневі тканини плоду для гістології та імуногістохімії висікали, зважували та фіксували у 4% PFA протягом 48 годин, а потім промивали та зберігали у PBS. Подальшу обробку, вбудовування, секціонування парафіну та фарбування гематоксиліном та еозином (H&E), а також фарбування періодичної кислоти-Шиффа (PAS) для гліогену проводили The Molecular Pathology Core в Південно-Західному медичному центрі UT в Далласі, як описано раніше (23, 39).

Проліферація клітин легенів плоду за допомогою імуногістохімії Ki-67.

Дозрівання легенів плода.

Щоб оцінити дозрівання легенів плода, патологічні слайди легенів H&E були оцінені патологом, засліпленим дизайном дослідження та умовами харчування, використовуючи методи, описані раніше (8). Коротко, дозрівання оцінювали за такою шкалою: 0 = псевдозалозиста стадія розвитку легенів (Е9,5–16,0); 1 = каналікулярний (Е16,6–17,4); 2 = каналікулярний/термінальний мішкоподібний (E17.5-післяпологовий день 5); 3 = кінцевий мішковий (17,4–18,2); і 4 = термінальний мішечковий/альвеолярний (18,2 до народження). Псевдогландулярна стадія розвитку легенів характеризувалася круглими канальцями, вистеленими одношаровим простим кубоподібним епітелієм або з відсутніми, або з невеликими просвітами. Каналікулярна стадія розвитку легенів характеризувалась розширеними канальцями, неправильної форми і вистеленими кубоподібним епітелієм, і капілярами, розташованими близько до канальців. Кінцева мішковидна стадія розвитку легенів була класифікована як така, що має більш складні канальці з бруньками без помітної епітеліальної оболонки. Мішечки відокремлені один від одного гладкостінними, потовщеними перегородками. На альвеолярній стадії розвитку легені легеня є зрілою, з повністю розвиненими альвеолами і витонченим ендотелієм.

Сліпа градація глікогену.

Дозрівання легенів у легенях плода при Е18 також оцінювали за допомогою напівкількісного фарбування PAS на глікоген, як описано раніше (7). Легені плоду швидко вирізали та швидко заморозили для поліпшення якості тканин. Кількісна оцінка вмісту цитоплазматичного глікогену в легенях плоду була проведена патологоанатомом, який не враховував схему дослідження. Протокол кількісного визначення глікогену проводився, як описано раніше (10). Коротко, інтенсивність фарбування глікогену оцінювали за такою шкалою: 0 = відсутність фарбування виявляється; 1 = перше виявлене фарбування; 2 = гранули цитоплазматичного глікогену в 60% клітин. Потім розраховували середній бал на материнську дієту.

Постнатальні дослідження щенят.

Підгрупа новонароджених цуценят залишалася у своїх мам на їх дієтах до постнатального 15-го дня. Цуценята знеболювали, живіт розкривали, а тварину знекровляли перерізом черевних судин. Проведена торакотомія, оголена трахея. Вставили тупу канюлю і прив’язали до трахеї. Легкі інфляцію фіксували закапуванням 4% PFA, забуференного PBS, під тиском води 25 см. Гістологічні зрізи легенів обробляли на пляму H&E, як описано вище.

Статистичний аналіз.

Розподіл даних перевірявся на нормальність за допомогою тесту нормальності Шапіро-Вілка. Засоби від нормально розподілених даних порівнювали за допомогою непарного двостороннього t-критерію, тоді як засоби від ненормально розподілених даних порівнювали за допомогою U-критерію Манна-Уітні. Значення P Рис. 1A). Хоча миші, опромінені HFD, були важчими на момент спарювання, їх збільшення у вазі під час вагітності було значно меншим, ніж у мишей, що зазнали чау (10,0 ± 0,20 проти 13,3 ± 0,2 г відповідно; P ≤ 0,001) (рис. 1B). Глюкоза в крові натще у матері була підвищена у мишей, що зазнали HFD, порівняно з мишами, яких годували чау (243 ± 15 проти 178 ± 5,9 ммоль/л, відповідно; P = 0,01) (рис. 1C). Крім того, рівень інсуліну в сироватці крові натще у матері був вищим у мишей, що піддавалися ВЧД, порівняно з мишами, що годувались чау (1,40 ± 0,15 проти 0,94 ± 0,15 нг/мл; Р ≤ 0,05) (рис. 1D).