Арабіноксиланові рисові висівки (MGN-3/Biobran) забезпечують захист від γ-опромінення всього тіла у мишей шляхом відновлення кровотворних тканин

Мамду Гонеум

1 кафедра отоларингології, Університет медицини і науки Чарльза Дрю, Лос-Анджелес, Каліфорнія, 90059, США

Наріман К. Бадр Ель-Дін

2 Відділ зоології, факультет наук, Університет Мансури, Мансура 35516, Єгипет

Сальма М. Абдель Фаттах

3 Дослідження наркотиків та радіації, Національний центр радіації та технологій, Каїр, Єгипет

Люцилен Толентіно

4 Кафедра патології, Університет медицини і науки Чарльза Дру, Лос-Анджелес, Каліфорнія, 90059, США

Анотація

ВСТУП

MGN-3 - це арабіноксилан із рисових висівок, полісахарид, що містить геміцелюлози β-1,4-ксилопіронази, оброблений ферментативно екстрактом грибів шиітаке [10]. Наша робота та інші роботи показали, що MGN-3 є потужним модифікатором біологічної відповіді (BRM), який, як відомо, активує дендритні клітини [11, 12], посилює активність NK-клітин [13, 14], модулює цитокіни та індукує апоптоз у пухлині тканини [15]. Попередні дослідження С. Накацугави (особисте спілкування, 2001) показали, що MGN-3 є дуже ефективним у підвищенні виживання мишей, що зазнали γ-опромінення, залежно від дози (діапазон 4,5–8,5 Гр). Згубний вплив іонізуючого випромінювання на живі клітини часто опосередковується збільшенням продукування активних форм кисню (АФК) [3]. Оскільки MGN-3 є ефективним антиоксидантним агентом у мишей, що проявляється запобіганням утворенню вільних радикалів, модулюванням перекисного окислення ліпідів, посиленням системи антиоксидантного захисту та захистом від окисного стресу [16], у цьому дослідженні ми розглядаємо захисний ефект MGN-3 про загальний вміст кровотворної тканини після γ-опромінення.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

У цьому дослідженні було використано 57 дорослих самок мишей швейцарських альбіносів віком приблизно 8 тижнів (середня вага тіла 24 ± 2 г). Мишей утримували 5/клітку і їм дозволяли вільний доступ до стандартних гранул лабораторного куба та води.

MGN-3/Біобран

MGN-3 - це модифікований екстракт рисових висівок, який обробляється ферментативно екстрактом з грибів шиітаке. Він містить полісахарид β1, 4-ксилопіроназу геміцелюлозу. Основною хімічною структурою MGN-3 є арабіноксилан з ксилозою в основному ланцюзі та арабінозним полімером у бічній ланцюзі [10]. MGN-3 свіжо готували за допомогою розчину в 0,9% фізіологічному розчині, і 40 мг/кг маси тіла/день давали мишам внутрішньочеревно (i.p.) через день одним пострілом 0,1 мл [15]. Лікування розпочато з 0-го дня і тривало протягом експериментального періоду. MGN-3 люб'язно надала компанія Daiwa Pharmaceuticals Co Ltd., Токіо, Японія.

Опромінення

Опромінення всього тіла проводили на мишах в NCRRT, Каїр, Єгипет, за допомогою клітини Gamma-40 (джерело цезію-137). Тварин поміщали в добре провітрювані контейнери та опромінювали при гострій одноразовій дозі 5 Гр, доставленій зі швидкістю дози 0,45 Гр/хв.

Експериментальний дизайн

57 мишей були розділені на чотири групи (G1 – G4). Група G1 служила контрольною групою необробленого сольового розчину (не отримуючи ні опромінення, ні MGN-3). Група G2 отримувала лише MGN-3 через день. Група G3 отримала γ-опромінення всього тіла через 2 тижні після початку експерименту. Групу G4 попередньо обробляли MGN-3 протягом 2 тижнів, потім піддавали опроміненню і продовжували отримувати MGN-3 через день. Тварин усіх груп евтаназували через 1 та 4 тижні після опромінення. Параметри, що досліджуються, включають коливання маси тіла та органів, загальний аналіз крові (CBC), гістопатологію багатьох органів та оцінку біомаркерів окисного стресу.

Зміна маси тіла

Початкову масу тіла тварин у чотирьох різних групах визначали, а потім вимірювали з інтервалами в 1 і 4 тижні після опромінення. Значимість відмінностей у масі тіла (БТ) внаслідок різних методів лікування - MGN-3, опромінення, MGN + опромінення - порівнювали з необробленими мишами.

Зміна маси органу

Через 1 і 4 тижні після опромінення досліджували ряд органів мишей G1 – G4. Сюди входили: печінка, серце, легені, селезінка, нирки, яєчка та мозок.

Дослідження гематології

Через 1 і 4 тижні після опромінення проби крові з G1 – G4 відбирали шляхом пункції серця за допомогою гепаринізованих пластикових шприців. Кров швидко переносили в антикоагуляційні пробірки для аналізу CBC, включаючи гемоглобін (Hb), гематокрит (Hct), загальну кількість еритроцитів (RBC), загальну кількість тромбоцитів (PLT) і загальну кількість лейкоцитів (WBC) з диференціальним показником.

Гістопатологія

Ряд органів, таких як кістковий мозок та селезінка, кожної миші досліджували на гістопатологічні зміни через 1 та 4 тижні після експозиції γ-опромінення. Органи фіксували в 10% розчині формаліну, розділяли і подавали в касети, фіксували на ніч, розділяли на ділянки товщиною 4 мкм і фарбували гематоксиліном та еозином (H&E). Кількість мегакаріоцитів у селезінці визначали під світловою мікроскопією.

Біохімічний аналіз

Досліджували здатність MGN-3 проявляти антиоксидантну активність у опромінених мишей, що опромінювали все тіло. Селезінки мишей при різних умовах лікування розтинали через 1 та 4 тижні після опромінення та аналізували на наявність різних параметрів окисного стресу. Селезінки гомогенізували в крижаному фосфатному буфері (0,1 моль/л, рН 7,4), використовуючи гомогенізатор Поттера-Ельвехема, отримуючи 10% гомогенат. Продукт перекисного окислення ліпідів (LPx), малоновий діальдегід (MDA), вимірювали за допомогою тесту на тіобарбітурову кислоту [17]. Вміст MDA в тканині селезінки визначали колориметрично з поглинання при 535 нм. Рівень продуктів перекисного окислення виражали як кількість MDA в тканині (мкмоль/г). Вміст GSH визначали, як описано раніше [18]; метод заснований на визначенні жовтого відтінку, який виникає при додаванні 5,5 дитиобіс- (2-нітробензойної кислоти) (DTNB) до сульфгідрильних сполук. Розроблений колір вимірювали спектрофотометрично при 412 нм. Результати виражали у мг/г тканини.

Статистичний аналіз

* Значно відрізняється від контрольної групи на рівні 0,05. ** Значно відрізняється від контрольної групи на рівні 0,01. # Значно відрізняється від групи MGN-3 на рівні 0,05. ## Значно відрізняється від групи MGN-3 на рівні 0,01. † Значно відрізняється від групи опромінення на рівні 0,05. †† Значно відрізняється від групи опромінення на рівні 0,01 (% зміни контрольної групи). Дані представляють зміни маси тіла ± SE.

Зміна маси органу

Досліджували зміну маси органу у мишей. Таблиця Таблиця 2 2 демонструє різну реакцію органів на вплив опромінення. Опромінення через 1 тиждень спричинило значну втрату ваги печінки, нирок та яєчок, тоді як інші органи, такі як серце, легені та мозок, не зазнали значних змін. Навпаки, лікування MGN-3 забезпечувало захист від втрати ваги органів у опромінених мишей через 1 тиждень після опромінення. Вага всіх органів за 4 тижні не показала змін у мишей за різних умов лікування.

Таблиця 2.

Зміна маси органу/г у мишей через 1 і 4 тижні після опромінення

Групи Контроль MGN-3ОпроміненняMGN-3 + Опромінення

Група	1 тиждень	4 тижні	1 тиждень	4 тижні	1 тиждень	4 тижні	1 тиждень	4 тижні
Кількість мишей	6	7	6	8	6	9	7	8
Печінка	1,09 ± 0,05	0,94 ± 0,07	1,10 ± 0,05 †† (1,2%)	0,92 ± 0,04 (-1,35%)	0,81 ± 0,024 ** (−25,51%)	0,87 ± 0,04 (−6,59%)	0,99 ± 0,061 † (−8,58%)	0,88 ± 0,04 (−5,77%)
Серце	0,11 ± 0,01	0,10 ± 0,005	0,12 ± 0,003 (3,24%)	0,11 ± 0,006 (15,61%)	0,10 ± 0,07 (-14,26%)	0,11 ± 0,009 (13,61%)	0,12 ± 0,01 (8,91%)	0,10 ± 0,007 (−2,96%)
Легені	0,175 ± 0,004	0,174 ± 0,009	0,186 ± 0,003 (6,4%)	0,176 ± 0,012 (1,13%)	0,152 ± 0,007 (-12,99%)	0,177 ± 0,009 (1,43%)	0,171 ± 0,03 (−1,84%)	0,179 ± 0,006 (2,85%)
Нирки	0,161 ± 0,007	0,122 ± 0,007	0,168 ± 0,01 †† (3,93%)	0,136 ± 0,008 (11,42%)	0,124 ± 0,006 ** (−23,19%)	0,130 ± 0,006 (6,49%)	0,169 ± 0,009 †† (5,04%)	0,123 ± 0,005 (0,48%)
Яєчка	0,132 ± 0,005	0,158 ± 0,007	0,136 ± 0,01 † (2,91%)	0,162 ± 0,01 (2,39%)	0,105 ± 0,007 * (−20,25%)	0,155 ± 0,014 (−1,67%)	0,124 ± 0,008 (−5,61%)	0,159 ± 0,011 (0,72%)
Мозок	0,348 ± 0,018	0,396 ± 0,009	0,355 ± 0,017 (1,87%)	0,411 ± 0,007 (3,55%)	0,337 ± 0,02 (-3,11%)	0,380 ± 0,019 (-4,20%)	0,357 ± 0,016 (2,71%)	0,413 ± 0,002 (4,09%)

* Значно відрізняється від відповідної контрольної групи на рівні 0,05.

** Значно відрізняється від відповідного контролю на рівні 0,01.

† Значно відрізняється від відповідної групи опромінення на рівні 0,05.

†† Значно відрізняється від відповідної групи опромінення на рівні 0,01 (% зміни контрольної групи).

Гематологічні дослідження

Було досліджено кілька гематологічних параметрів, щоб продемонструвати захисний ефект MGN-3 через 1 та 4 тижні після впливу γ-опромінення. Сюди входили індекси еритроцитів, загальний рівень лейкоцитів з диференціальним підрахунком та підрахунок PLT.

Індекси РБК

Ми досліджували вплив опромінення та лікування MGN-3 на показники еритроцитів, включаючи кількість еритроцитів, Hb та Hct. Рис. Рис. 1 1 узагальнює зміни індексів еритроцитів через 1 та 4 тижні після опромінення. Опромінення спричинило анемію (нижчий рівень еритроцитів, Hb та Hct) у мишей через 1 та 4 тижні. Однак лікування MGN-3 до опромінення запобігло зниженню цих параметрів через 1 тиждень і підтримувало їх протягом 4 тижнів. Миші, оброблені лише MGN-3, демонстрували показники еритроцитів у межах значень контрольних необроблених мишей.

Серія еритроцитів у мишей під різною обробкою через 1 та 4 тижні після опромінення. A) Кількість еритроцитів, B) вміст гемоглобіну (Hb) та C) показники гематокриту (Hct) через 1 та 4 тижні після початкового лікування. Кількість мишей в групі 6–9. Одна зірочка вказує на значну відмінність від контрольної групи на рівні 0,05. Дві зірочки вказують на значну відмінність від контрольної групи на рівні 0,01. Один кинджал вказує на значну відмінність від групи опромінення на рівні 0,05. Два кинджали вказують на значну різницю від групи опромінення на рівні 0,01 (різниця у% від контрольної групи).

Підрахунок лейкоцитів та диференціал

Дані, показані на рис. Рис. 2, 2 - це узагальнення змін у кількості лейкоцитів та відсотках лімфоцитів, моноцитів та нейтрофілів у мишей за різних умов лікування. Дані показують, що опромінення викликало лейкопенію у мишей через 1 тиждень (P Рис. 3 3 вказує на наявність тромбоцитопенії у мишей після експозиції до опромінення на 1 та 4 тижні. На відміну від цього, лікування мишей MGN-3 до опромінення забезпечували захист від тромбоцитопенії через 1 і 4 тижні після опромінення. Ми також спостерігали тромбоцитоз у неопромінених мишей, які отримували лише MGN-3 через 1 тиждень (2,44%), що було максимізовано через 4 тижні (8,73%) порівняно з контрольними мишами.

Вміст тромбоцитів у мишей під різною обробкою через 1 та 4 тижні після опромінення. Кількість мишей в групі 6–9. Одна зірочка вказує на значну відмінність від відповідної контрольної групи на рівні 0,05. Дві зірочки означають значну відмінність від відповідної контрольної групи на рівні 0,01. Два кинджали вказують на значну різницю від групи опромінення на рівні 0,01 (різниця у% від контрольної групи).

Гістопатологічні дослідження

Мишей гістопатологічно досліджували на предмет можливих змін їхнього кісткового мозку та селезінки внаслідок опромінення та лікування MGN-3.

Кістковий мозок

Дані, проілюстровані на рис. Рис. 4 4, вказують на значну гіпоцелюлярність у кістковому мозку опромінених мишей через 1 тиждень, на що вказує здебільшого відсутність клітин кісткового мозку. На відміну від цього, лікування MGN-3 перед опроміненням забезпечувало повний захист клітин кісткового мозку. Через 4 тижні після опромінення у мишей, що зазнали опромінення, відбулося часткове відновлення клітинності кісткового мозку.

Гістологічні зрізи кісткового мозку у мишей, що зазнали впливу γ-опромінення, з або без обробки MGN-3, через 1 і 4 тижні після опромінення. Кожен переріз містить збільшене зображення. A) Контрольна група, відсутність лікування опроміненням або MGN-3 (100% клітинність кісткового мозку). B) Миші, оброблені лише MGN-3 (100% клітинність кісткового мозку). В) Миші, опромінені лише опроміненням, через 1 тиждень після опромінення (помітно зменшено до відсутності клітин кісткового мозку). D) Миші, оброблені MGN-3 і піддані опроміненню, через 1 тиждень після опромінення (100% клітинність кісткового мозку). E) Миші, що зазнали опромінення лише через 4 тижні після опромінення (часткове відновлення клітинності кісткового мозку). F) Миші, оброблені MGN-3 і піддані опроміненню, через 4 тижні після опромінення (клітинність кісткового мозку 80%).

Селезінка

Зміни маси/відносного розміру селезінки у мишей, що зазнали γ-опромінення у присутності або за відсутності обробки MGN-3, показані на фіг. Фіг. 5 5 та 6. 6. Вплив опромінення призвів до значних змін у селезінці мишей через 1 тиждень після опромінення, що проявилося зменшенням маси/відносного розміру селезінки на 60% порівняно з контрольними мишами (P Рис. 7A. 7 A. суттєва різниця між необробленою контрольною групою та групою, яка отримувала лише MGN-3. Миші, опромінені опроміненням, продемонстрували помітне підвищення вмісту MDA. Ці значення становили 106,34% (P Рис. 7B. 7 B. Не було значної різниці між у нелікованої контрольної групи та групи, яка отримувала лише MGN-3. Опромінені миші продемонстрували значне зниження (–40%, P Petersen C, Würschmidt F. Пізня токсичність променевої терапії: проблема чи проблема для променевого онколога? Груди Догляд (Базель) 2011; 6: 369–74. [Безкоштовна стаття PMC] [PubMed] [Google Scholar]