Вроджена ліподистрофія викликає важкий остеосклероз

Ролі Концептуалізація, курація даних, формальний аналіз, написання - оригінальний проект

ліподистрофія

Афілійований відділ анатомічної та молекулярної патології, Департамент патології та імунології, Медичний факультет Вашингтонського університету, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Концептуалізація, курація даних

Афілійований відділ анатомічної та молекулярної патології, Департамент патології та імунології, Медичний факультет Вашингтонського університету, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Курація даних, дослідження, перевірка

Афілійований відділ лабораторної та геномної медицини, Департамент патології та імунології, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Курація даних

Відділ анатомічної та молекулярної патології, Відділення патології та імунології, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки, Центр поступальної медицини, Перша афілійована лікарня Університету Сіань Цзяотонг, Сіань, Шаньсі, Китайська Народна Республіка

Ролі Концептуалізація, курація даних

Афілійований відділ хвороб кісток та мінералів, Медичний факультет, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Концептуалізація, курація даних

Афілійований відділ хвороб кісток та мінералів, Медичний факультет, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Курація даних

Афілійований відділ ортопедичної хірургії, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Курація даних

Афілійований відділ ортопедичної хірургії, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Концептуалізація, написання - огляд та редагування

Афілійований відділ ортопедичної хірургії, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Концептуалізація, формальний аналіз, візуалізація

Афілійований відділ ендокринології, метаболізму та досліджень ліпідів, Медичний факультет, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки

Ролі Концептуалізація, придбання фінансування, нагляд, написання - огляд та редагування

Відділ анатомічної та молекулярної патології, Кафедра патології та імунології, Медичний факультет Університету Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі, Сполучені Штати Америки, Відділ кісткових та мінеральних захворювань, Медичний факультет, Медичний факультет Університету Вашингтона Луї, Міссурі, Сполучені Штати Америки

  • Вей Цзоу,
  • Нідхі Рохаджі,
  • Джонатан Р. Брестофф,
  • Янь Чжан,
  • Еріка Л. Шеллер,
  • Клариса С. Ремесло,
  • Майкл Д. Бродт,
  • Ніколь Мігоцький,
  • Метью Дж. Сільва,
  • Чарльз А. Гарріс

Цифри

Анотація

Вроджена генералізована ліподистрофія Берардінеллі-Сейпа пов'язана зі збільшенням кісткової маси, що свідчить про те, що жирова тканина регулює скелет. Оскільки щодо цього питання існує мало механістичної інформації, ми створили мишей "без жиру" (FF), у яких повністю відсутній видимий вісцеральний, підшкірний та коричневий жир. Через стійку остеобластичну активність у цих тварин помітно збільшується об’єм трабекулярної та коркової кісток. Миші FF, як і пацієнти Берардінеллі-Сейпа, хворі на цукровий діабет, але нормалізація толерантності до глюкози та значне зниження циркулюючого інсуліну не змінює їх скелетний фенотип. Важливо, що скелетний фенотип мишей FF повністю врятовується трансплантацією попередників адипоцитів або депо білого або коричневого жиру, що вказує на те, що продукти, отримані з адипоцитів, регулюють кісткову масу. Підтвердженням такої ситуації є те, що трансплантація жиру, отриманого з адипонектину та лептину з подвійним нокаутом мишам, на відміну від того, що отримано від їх аналогів із ВТ, не приводить до нормалізації кісткової тканини. Ці спостереження припускають, що нестача лептину та адипонектину може сприяти збільшенню кісткової маси пацієнтів Берардінеллі-Сейпа.

Резюме автора

Вроджена генералізована ліподистрофія Берардінеллі-Сейпа - це розлад людини, пов’язаний із збільшенням кісткової маси, що свідчить про те, що жир сам по собі регулює скелет. Для перевірки цієї гіпотези ми створили мишачу модель вродженої генералізованої ліподистрофії, в якій як коричнева, так і біла жирова тканина повністю виснажуються під час ембріогенезу. Ці «знежирені» (FF) демонструють помітне збільшення кісткової маси у всьому тілі. Збільшена кісткова маса представляє стимуляцію формування кісток і не сповільнене руйнування кісток. Крім того, збільшена кісткова маса мишей FF помітно збільшує міцність скелета та стійкість до переломів. Як і пацієнти з вродженою ліподистрофією, миші FF хворі на цукровий діабет, але їх метаболічний стан не сприяє збільшенню їх кісткової маси. Для ідентифікації молекул, що виробляються з жиру, що регулюють кісткову масу, ми трансплантували генетично модифіковану жирову тканину мишам FF, які встановили, що відсутність утворених жиром молекул, адипонектину та лептину, значно посилює формування кісток. Ці спостереження свідчать про те, що зменшення комбінованого впливу адипонектину та лептину на кістку збільшить її чисельність та стійкість до переломів.

Цитування: Zou W, Rohatgi N, Brestoff JR, Zhang Y, Scheller EL, Craft CS та ін. (2019) Вроджена ліподистрофія викликає важкий остеосклероз. PLoS Genet 15 (6): e1008244. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008244

Редактор: Роланд Барон, пероральна медицина, інфекція та імунітет, Гарвардська школа стоматології, США

Отримано: 2 січня 2019 р .; Прийнято: 12 червня 2019 р .; Опубліковано: 24 червня 2019 р

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в рукописі та в допоміжних файлах.

Фінансування: Ця робота була підтримана грантом Дитячого інституту відкриття MI-F-2019-795 (JRB); Національні інститути охорони здоров’я надають гранти R37 AR046523 (SLT), R01 DK111389 (SLT), P30 AR057235 (SLT, CSC та MJS), R00 DE024176 (ELS), R01 AR047867 (MJS) та R01 DK106083 (CAH). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Останні десятиліття були свідками елегантних досліджень взаємозв'язку енергетичного обміну та кісток, роблячи висновок, що вони взаємно регулюються. За цим сценарієм вибрані адипокіни впливають на скелетну масу шляхом прямого та опосередкованого націлювання на остеобласти та остеокласти [1–4]. Ці дослідження, багато з яких надають суперечливі дані, зазвичай включають фармакологічні або генетичні зміни чисельності адипокіну. Усвідомлення того, що різні депо білої жирової тканини (WAT) мають різні фізіологічні ефекти, дало змогу зрозуміти цю загадку [5–7]. У той час як підшкірний жир, що перебуває переважно в стегнах і сідницях, корелює з посиленою кістковою масою, збільшення вісцерального жиру, що характеризує метаболічний синдром, пов’язане з остеопорозом [1–3, 6]. Чому відбувається ця різниця, однак, до кінця невідомо, а також не існує механістичних доказів причинно-наслідкового зв’язку між жиром та великою кількістю кісток.

Результати

Покоління мишей FF

Як описано [9], покоління FF-мишей включало схрещування тих, хто несе трансгенний дифтерійний токсин (DTA) нижче за флокс-стоп-кодоном (DT-STOP fl/fl) мишам, що експресують адипонектин Cre (+/-). Кремітники служать контролем. Відповідно до унікальної експресії адипонектину Cre в адипоцитах та їх попередниках, усі продукти спарювання Cre + не містять помітного ВАТ, підтвердженого практично не виявленими циркулюючими адипонектином або лептином, а також вісфатином та резистином [10] (рис. 1). BAT також відсутній, і як результат, миші FF не переносять холоду, оскільки їм потрібно житло при температурі 30 ° C, щоб вижити до відлучення. Несподівано кількість адипоцитів кісткового мозку у мишей FF не змінюється. Вага тіла мишей FF поступово зменшується з віком щодо WT, але різниця не досягає статистичної значущості до 20 тижнів. Немає змін у зростанні, що підтверджується довжиною стегна, і миші FF мають значну спленомегалію (S1 Рис.).

Адипокіни сироватки крові контрольних та FF мишей. Дані представлені як середнє значення ± SD. *** p Рис. 2. Вроджена відсутність жиру сприяє остеосклерозу.

А) Рентгенограми стегнових кісток 3-місячних контрольних та FF-мишей. B) Вікові залежні μCT зображення стегнових кісток FF та контрольних одноплідників. C) Кількісний аналіз μCT B. D) Гістоморфометричний аналіз обсягу трабекулярної кістки 3-місячного FF та контрольної гомілки. E) μCT зображення хребців (L3-5) 3-місячного віку контрольних та FF однолітніх. F) Кількісний аналіз μCT обсягу трабекулярної кістки та мінеральної щільності кісток E. Дані представлені як середнє значення ± SD. * p Рис. 3. Вроджена відсутність жиру сприяє формуванню кісток.

A) Сироватковий остеокальцин FF та контрольних мишей. B) qPCR-аналіз маркерів диференціації остеобластів, присутніх у РНК, виділеній із стегнових кісток 6-тижневого FF та контрольних мишей. В) Флуоресцентні мікроскопічні зображення дистального відділу стегнової кістки контрольних та мишей FF, яким вводили кальцеїн з часовим інтервалом. Шкала шкали: 400 мкм. Г) Гістоморфометричний аналіз загальної швидкості формування кісткової тканини (BFR), швидкості формування кісткової тканини на мм трабекулярної поверхні (BFR/BS) та швидкості прилягання мінеральних речовин (MAR) трабекулярної кістки. E) контроль за допомогою TRAP (червоний продукт реакції) та FF стегнової кістки. Ендокортикальна поверхня FF вистелена стовпчастими остеобластами (стрілками), характерними для міцного формування кісток. Шкала шкали: 800 мкм. F) Гістоморфометричний аналіз ендокортикальної MAR. Ж) Гістоморфометричний аналіз періостальної MAR. Дані представлені як середнє значення ± SD. * p Рис. 4. Вроджена відсутність жиру збільшує кількість остеокластів, але не функціонує.

A) Сироватка TRAP5b FF та контрольних мишей. Б) Гістоморфометричний аналіз кількості остеокластів/мм поверхні кістки. В) qPCR-аналіз маркерів диференціації остеокластів, присутніх у РНК, виділеній із стегнових кісток 6-тижневого FF та контрольних мишей. D) TRAP пофарбований FF та контрольні кістки. Шкала шкали: 100 мкм. E) Співвідношення сироваткового CTx до TRAP5b FF та контрольних мишей. Дані представлені як середнє значення ± SD. * p Рис. 5. Вроджена відсутність жиру посилює міцність кісток.

Аналіз згинальних тестів FF та контроль жорсткості стегнової кістки (A) та (B) граничної сили (показник міцності цілої кістки). (C) μCT-аналіз області діафізарної кістки. (D) Полярний момент інерції. (E) Витіснення після врожаю. (F) Робота до руйнування. Дані представлені як середнє значення ± SD. * p Рис. 6. Остеосклероз мишей FF не викликаний метаболічним синдромом.

A) Зліва: жирова маса (стрілка) у миші FF через 4 місяці після підшкірної трансплантації MEF. Вправо: трансплантація WEF MEF нормалізує розмір печінки FF (зірка). B) Гістологічне зображення жирової маси у миші FF через 4 місяці після підшкірної трансплантації MEF; Вага: 1 мм. В) Гістологічні зображення печінки FF, що демонструють важкий стеатоз (ліва панель) у підроблених оперованих мишей та його усунення трансплантацією MEF (права панель). Шкала шкали: 400мкм. D) зображення μCT та E) кількісний аналіз трабекулярного об’єму та мінеральної щільності кісткової тканини дистальних відділів стегнових кісток мишей FF через 4 місяці після підробленої операції або трансплантації MEF. F) Гістоморфометричний аналіз об’єму трабекулярної кістки великогомілкової кістки та кількості остеокластів у контрольних групах WT та мишах FF через 4 місяці після фіктивної операції або трансплантації MEF. G) Рентгенограми стегнових кісток мишей FF через 3 місяці після підробленої операції або трансплантації різних жирових депо. H) Аналіз μCT трабекулярного обсягу кістки та мінеральної щільності кісток дистальних відділів стегнових кісток мишей FF через 3 місяці після підробленої операції або трансплантації різних жирових депо. Дані представлені як середнє значення ± SD. * p Рис. 8. Відсутність лептину та адипонектину помірковано остеосклероз FF.

А) Трансплантовані жирові депо через 3 місяці після операції. Б) Вага жирової депо через 3 місяці після трансплантації. В) Сироватковий лептин та адипонектин мишей FF через 3 місяці після трансплантації жирового депо. WT та нетрансплантовані FF миші служать контролем. D) Аналіз μCT трабекулярного обсягу кістки та мінеральної щільності кісткової тканини дистальних відділів стегнових кісток мишей FF через 3 місяці після підробленої операції або трансплантації жиру, отриманого від WT або мишей з дефіцитом адипокіну. Дані представлені як середнє значення ± SD. ** p -, TER-119 -, CD41 -, CD11b -, клітини LepR +.

GTT та ITT

Тести на толерантність до глюкози (ГТТ) проводили на 2-місячних самцях мишей у чистих клітках, підданих голодуванню, із вільним доступом до води протягом 6 годин. Мишей зважували і отримували невелику кількість крові з хвостової вени для вимірювання рівня глюкози на вихідному рівні (час 0). Потім мишам внутрішньочеревно вводили 50% стерильну декстрозу (1 мг/г маси тіла). Глюкозу в хвості крові визначали через 15, 30, 60, 90 та 120 хв після зараження за допомогою глюкометра Байєра Контура. Для тесту на толерантність до інсуліну (ITT) 2-місячних мишей-самців поміщали в чисті клітини без їжі та вільного доступу до води. Після 6-годинного голодування мишей зважували та відбирали вихідні показники глюкози за допомогою глюкометра Bayer Contour. Мишам вводили внутрішньочеревно інсулін людини (гумулін, Елі-Ліллі) у дозі 0,7 Од/кг маси тіла та глюкозу крові, виміряну через 15, 30, 45, 60, 90, 120 хв після ін’єкції інсуліну.

Гістологія та гістоморфометрія

Стегнову кістку та гомілку фіксували у 10% нейтральному буферизованому формаліні, після чого проводили декальцифікацію у 14% ЕДТА протягом 10 днів, вбудовування парафіну та фарбування TRAP. Статичні та динамічні гістоморфометричні параметри вимірювали за допомогою BioQuant OsteoII (BioQuant Image Analysis Corporation, Нашвілл, Теннессі) сліпо.

Маркування кальцеїном

Двомісячним чоловікам FF та контрольним односмітникам вводили внутрішньочеревно кальцеїн (Sigma) (7,5 мг/кг маси тіла) на 6 та 2 дні перед жертвою. Гістологічні зрізи стегнової кістки без декальцину аналізували за допомогою BioQuant OsteoII (BioQuant Image Analysis Corporation, Nashville, TN).

Мікрокомп'ютерна томографія (μCT)

Трабекулярну кістку сканували за допомогою сканера μCT40 (Scanco Medical AG, Бассерсдорф, Швейцарія; 55 кВп, 145 мкА, час інтеграції 300 мс, розмір вокселя 16 мкм). Нижній поріг 250 був використаний для оцінки всіх сканувань. Цікава область трабекулярної кістки складалася із 100 зрізів, які були намальовані, починаючи з першого зрізу, на якому виростки та первинна спонгіоза більше не були видні, складаючи довжину 1,6 мм. Область інтересу кортикальних аналізів складалася з 50 зрізів довжиною 0,8 мм на середній вал стегнової кістки.

Трансплантація жиру

Первинні ембріональні фібробласти мишей (MEF) готували з ембріонів WT C57/BL6 E14, як описано [9, 45]. Як повідомлялося, MEF вводили підшкірно в грудину 2-місячним мишам FF [9, 46]. Мишей забивали через 4 місяці після трансплантації.

Зрілі жирові депо пересаджували, як описано [47], з невеликими змінами. 2-місячних мишей FF знеболювали ізофлураном. Донорові жирові прокладки від 6–8-тижневих ВТ або мишей із дефіцитом адипокіну поміщали в стерильний PBS і розрізали на шматочки по 100-150 мг. Трансплантати імплантували підшкірно через невеликі розрізи на поголеній шкірі спини, по 1 штуці на розрізи. У кожну мишку FF імплантували 6 шматочків жирового трансплантата. Після операції мишей утримували індивідуально протягом тижня, а потім 5 мишей на клітку. Мишей забивали через 3 місяці після трансплантації.

Біомеханіка

Стегнові кістки (n = 5 на групу) сканували за допомогою microCT на середньому валу (Scanco uCT40; 70 кВп, 114 мА, час інтеграції 300 мс, розмір вокселя 10 мкм, 100 зрізів) для визначення геометричних властивостей поперечного перерізу. Потім вони були механічно випробувані на відмову в триточковому режимі очікування (Instron 8841; проліт опори: 7 мм; швидкість переміщення: 0,1 мм/сек). Збій стався безпосередньо під точкою завантаження, на 50% довжини стегнової кістки. Дані про зміщення зусилля були зібрані та проаналізовані для визначення механічних властивостей цільної кістки (структурних) (жорсткість, гранична сила, зміщення після виходу, робота до руйнування) [14].

Статистика