Вплив вмісту жирних кислот у харчуванні на плечовий хрящ та структуру кісток у мишачої моделі ожиріння, спричиненого дієтою

Кафедра ортопедичної хірургії, Вашингтонський університет, Диван Біомедичних досліджень, кімната 3121, Кампус-бокс 8233, Сент-Луїс, Міссурі, 63110

Шрінерські лікарні для дітей - Сент-Луїс, Сент-Луїс, штат Міссурі 63110

Кафедра біомедичної інженерії Вашингтонського університету, Сент-Луїс, штат Міссурі, 63110

Кафедра ортопедичної хірургії, Вашингтонський університет, Диван біомедичних досліджень, кімната 3121, кампус Бокс 8233, Сент-Луїс, штат Міссурі, 63110

Шрінерські лікарні для дітей - Сент-Луїс, Сент-Луїс, штат Міссурі 63110

Кафедра біомедичної інженерії Вашингтонського університету, Сент-Луїс, штат Міссурі, 63110

Листування до: Фаршид Гілак (T: + 314‐362‐7239; електронна пошта: [email protected])

Шрінерські лікарні для дітей - Сент-Луїс, Сент-Луїс, штат Міссурі 63110

Кафедра біомедичної інженерії Вашингтонського університету, Сент-Луїс, штат Міссурі, 63110

Шрінерські лікарні для дітей - Сент-Луїс, Сент-Луїс, штат Міссурі 63110

Кафедра біомедичної інженерії Вашингтонського університету, Сент-Луїс, штат Міссурі, 63110

Листування до: Фаршид Гілак (T: + 314‐362‐7239; електронна пошта: [email protected])

АНОТАЦІЯ

Для більш прямого вивчення механізмів, що пов'язують ожиріння та ОА, розроблені тваринні моделі ожиріння, що використовують або дієту з високим вмістом жиру 10-14, або генетичну абляцію передачі сигналів про лептин (наприклад,., об/об або дб/дб миші). 15 Багаточисельні дослідження показали підвищений ступінь тяжкості спонтанного ОА 15-17 або індукованого травмою ОА 7, 13, 14 у тварин, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру, але відсутність спонтанного ОА у мишей із ожирінням та дефіцитом лептину, які харчуються стандартною дієтою чау . 15

Також спостерігається все більше доказів того, що дієтичний склад сам по собі може сприяти індукованому ожирінням ОА. На додаток до калорійності, є все більше доказів того, що склад дієти, зокрема вміст жирних кислот, може суттєво впливати на тяжкість ОА в суглобовій специфіці. 7, 10, 18, 19 Наприклад, дієти з високим вмістом жиру, що складаються в основному з насичених жирних кислот (SFA) або поліненасичених жирних кислот ω ‐ 6 (PUFA), демонструють значно гірший ОА коліна, спричиненого травмою, ніж аналоги, які відповідають вазі. жирна дієта з ω ‐ 3 ПНЖК або звичайна дієта для миші на чау. 10 У цих дослідженнях було виявлено, що дієта з високим вмістом жиру, доповнена ω-3 ПНЖК, захищає коліно від ОА, спричинених травмами, тоді як дієти з високим вмістом жиру, багаті СФА та ω-6 ПНЖК, посилюють дегенерацію хряща та синовіт після травми коліна. Однак не спостерігається значного впливу підвищених харчових ω ‐ 3 ПНЖК на розвиток спонтанного ОА в колінному суглобі. 7, 10, 20

Метою цього дослідження було визначити, чи вміст жирних кислот в їжі впливав на появу спонтанних ОА та змін кісткової структури плеча у мишей із ожирінням, спричинених дієтою. Мишей годували або дієтою з чау-контролем з низьким вмістом жиру, або дієтами з високим вмістом жиру, багатими ω-3 PUFA, ω-6 PUFA або SFA. Ми припустили, що дієта, багата на PUFA ω ‐ 3, матиме захисний ефект на хрящі та кістки плеча. Кістку, хрящ та синовію головки плечової кістки аналізували на зміну, пов’язану з ОА, за допомогою мікро-комп’ютерної томографії (MicroCT) для вивчення мікроструктури кісток, атомно-силової мікроскопії (AFM) для вивчення механічних властивостей мікромасштабу хряща та гістологічної оцінки за оцінити дегенерацію хряща та синовіальне запалення.

МЕТОДИ

Модель тварини

Починаючи з 4-тижневого віку, самців мишей C57BL/6J годували протягом 24 тижнів або контрольною дієтою з низьким вмістом жиру (10% ккал жиру), або однією з трьох дієт з високим вмістом жиру (60% ккал жиру), багатих ω-3 ПНЖК, ω ‐ 6 PUFA або SFA. Ці миші були спочатку розроблені для попереднього дослідження, що досліджувало, як дієтичні жирні кислоти впливають на розвиток ОА коліна, і були повідомлені дані про вміст у їжі, вагу тіла, тяжкість ОА коліна, вимірювання цитокінів та ліпідів у сироватці крові та відповідь на загоєння рани у вусі. 7, 10 Таким чином, в цьому дослідженні не використовувались живі тварини, але всі попередні процедури використання тварин були затверджені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин. 7, 10 Усі зразки зберігали при -20 ° C після евтаназії. Перед аналізом зразки розморожували при 4 ° C та ізолювали головки плечової кістки.

Аналіз MicroCT трабекулярної та коркової кісток

Гомілкові головки фіксували в 4% параформальдегіді протягом 24 годин при кімнатній температурі (n = 12–15 для групи дієт). Потім зразки зневоднювали в етанолі та сканували на повітрі за допомогою MicroCT (SkyScan 1176, Bruker, Billerica, MA) з роздільною здатністю 9 мкм/піксель, рентгенівською напругою 55 кВ, струмом 455 мкА, часом витримки 980 мс, 3-кратним середнім значенням кадру, а також промінна фільтрація з алюмінієвим фільтром 0,5 мм. Мінеральну щільність кісток калібрували за допомогою фантомів гідроксиапатиту (Bruker). Трабекулярні ділянки головки плечової кістки визначали як обсяг між субхондральною кістковою пластинкою та проксимальною пластиною росту. Кожну область аналізували за допомогою розширення BoneJ у ImageJ. Обчислювали об'ємну частку трабекулярної кістки (BV/TV), товщину трабекули (Tb.Th) та трабекулярну сепарацію (Tb.Sp). Кісткові ділянки кори аналізували за допомогою автоматизованого програмного пакету CTan (Bruker). Площа поперечного перерізу та товщини кіркової тканини розраховувались з 20 зрізів, розташованих у двох діафізарних областях: 0,5 мм від дистального відділу головки плечової кістки та в дистальному аспекті дельтоподібної горбистості (n = 6–14).

Атомно-силова мікроскопія

Консольне відхилення та переміщення z ‐ пьезо записували для кожного місця з відступом за допомогою програмного забезпечення Asylum Research та аналізували за допомогою спеціального сценарію MATLAB (The MathWorks, Natick, MA). Модуль пружності тканини визначали за допомогою модифікованої моделі Герца, як описано раніше. 28, 31-33 Екстраполяція точки контакту була використана для визначення точки, в якій консоль контактувала з поверхнею. Зображення флуоресценції накладали на карти жорсткості, щоб ідентифікувати кожне місце вдавлення як ECM або PCM. Точки аналізу всередині клітинного тіла були виключені з подальшого аналізу. Точки даних також виключались, якщо вони перевищували в 2,5 рази середнє значення навколишніх значень; у цьому випадку їх замінили середнім значенням сусідніх точок. Для побудови модуля в залежності від відстані від центру клітини флуоресцентне зображення кожної області клітини було пороговим у MATLAB, і середні модулі були розраховані для кожного кільця товщиною 0,5 мкм, визначеного радіально, починаючи з краю комірки. Через високу щільність хондроцитів у мишачому хрящі середній модуль був усічений до максимального значення, щоб уникнути включення областей PCM із сусідніх хондроцитів.

Гістологічний аналіз та класифікація

Гомілкові головки фіксували у 4% параформальдегіді, декальцинували за допомогою Calex II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) та вкладали у парафін. Зразки розділяли на 8 мкм і фарбували за допомогою сафраніну-О, швидкого зеленого та гематоксиліну для класифікації ОА або гематоксиліну та еозину для класифікації синовіту. Фенотип хряща оцінювали за допомогою модифікованої системи оцінки Манкіна двома засліпленими особами. 7, 13 Дана оцінка складалася з наступних категорій: структура поверхні хряща (0–11), дублювання типу «трімарк» (0–3), фарбування сафраніну-0 (0–8), клони хондроцитів у некальцинованому хрящі (0–2), гіпертрофічні хондроцити в кальцифікованому хрящі (0–2) та товщині субхондральної кістки (0–2). Загальна кількість балів становила 28. Синовіальне запалення оцінювалося двома засліпленими балами, використовуючи встановлену бальну систему. 13 Це складалося з наступних категорій: Збільшення шару клітин синовіальної оболонки (0–3) та щільність клітин у синовіальній оболонці (0–3). Товщину не кальцинованого та кальцифікованого хряща та субхондральної пластинки визначали за допомогою репрезентативних гістологічних зображень. В середньому було проведено п’ять вимірювань товщини для кожного з’єднання.

Статистичний аналіз

Значимість між групами дієт для кісток та результатів AFM визначали односторонніми ANOVA та Tukey пост-хок тести. Для дискретних гістологічних оцінок значимість визначали за допомогою тесту Крускала – Уолліса. Дані представлені як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення (SEM). Вибірки визначали за допомогою тесту ROUT (Питання = 1%). Усі статистичні дані проводились у Prism 7.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

РЕЗУЛЬТАТИ

Аналіз MicroCT епіфізарної області плечової кістки (рис. 1А) не показав впливу дієтичного складу жирних кислот на МЩКТ (рис. 1В) або Tb.Th (рис. 1D). Об'ємна частка кісток BV/TV (рис. 1C) і Tb.Sp (рис. 1E) суттєво відрізнялися між групами дієт. BV/TV суттєво знизився як у групах дієти ω ‐ 6, так і у складі SFA, тоді як Tb.Sp збільшився лише для групи дієт SFA порівняно з групою контрольної дієти.

У кірковій кістці було проаналізовано дві області, які показані як проксимальна кіркова область та дистальна кіркова область (рис. 2А). Більш виражені зміни МЩКТ можна спостерігати в дистальній ділянці кори, але в обох регіонах були виявлені суттєві відмінності внаслідок дієти (рис. 2B і C). Цікаво, що дієта з насиченими жирами демонструє нижчий показник МЩКТ у проксимальній області, але не в дистальній ділянці. У проксимальній області зменшення площі спостерігалось лише у групи дієти ω ‐ 3 (рис. 2D); однак усі дієти з високим вмістом жиру призвели до значного зменшення середньої площі поперечного перерізу в дистальній області відносно стандартних контролів чау (рис. 2Е). Товщина кортикальної зони проксимальної області у групі ω-3 також суттєво зменшилася порівняно з усіма іншими дієтами (рис. 2F), але товщина дистальної області не показала залежності від дієти (рис. 2G).

Механічні випробування з використанням АФМ, керованого імунофлуоресценцією (рис. 3А), не показали значних змін у значеннях модулів хряща як для основного ЕКМ, так і для РСМ, що оточує хондроцити (рис. 3С). Перехід модуля з більш м'якого ПКМ на більш жорсткий ЕКМ не був суттєво змінений дієтою, хоча миші, які годувались раціоном SFA, демонстрували тенденцію до зменшення модуля (рис. 3D). Репрезентативна карта жорсткості (рис. 3B) показує більш м'який PCM, що оточує клітину, і поступовий прогрес до більш жорсткого ECM.

Репрезентативне гістологічне зображення голови плечової кістки контрольної групи показано на малюнку 4А, а збільшені зображення поверхні хряща від кожної дієтичної групи - на малюнку 4B. Хоча загальний змінений бал Манкіна не показав жодних відмінностей з дієтою (рис. 5А), дві підкатегорії варіювались залежно від дієти. Кількість гіпертрофічних хондроцитів у кальцифікованому хрящі (рис. 5B) значно зросла у групах ω ‐ 6 та SFA порівняно з ω ‐ 3 та контрольними дієтами. Крім того, кількість клонів хондроцитів у некальцинованому хрящі (рис. 5C) значно зменшилась у дієті ω ‐ 6 порівняно з усіма іншими групами дієти. Підтверджуючи відсутність фенотипу хряща, відповідна товщина не кальцинованих (рис. 5D) та кальцифікованих (рис. 5E) хрящових областей також не залежала від дієти. Однак товщина субхондральної кісткової пластинки, виміряна за гістологічними зображеннями, суттєво зменшилась при дієті ω ‐ 3 порівняно з усіма іншими групами дієт (рис. 5F).

Ступінь синовіального запалення оцінювали за допомогою шкали класифікації синовітів, враховуючи як товщину, так і клітинність синовіальної оболонки. Репрезентативні гістологічні зрізи для кожної групи дієт наведені на малюнку 6А. Статистично значущих відмінностей у загальній чисельній оцінці синовіального запалення не виявлено (рис. 6В).

ОБГОВОРЕННЯ

Це дослідження показало, що жирнокислотний склад дієт з високим вмістом жиру, за відсутності пошкодження суглобів, спричинив значні зміни в якості кісток плечової кістки. Зокрема, дієта, багата на PUFA-3, захищає від втрати плечової кістки порівняно з дієтами з високим вмістом жиру, що містять ω-6 та SFA. Навпаки, мало властивостей суглобового хряща з дієтичним складом жирних кислот спостерігалося навіть на мікромасштабі. Зміни, які спостерігались, наприклад, збільшення кількості гіпертрофічних хондроцитів, можуть бути пов'язані з реконструкцією кісток.

Загальновизнано, що формування та якість кісток можуть, принаймні, частково залежати від рівня активності (тобто потенційного навантаження на скелет). 49 Незважаючи на той факт, що в нашій попередній опублікованій роботі ми не спостерігали значних змін у спонтанній руховій активності у мишей, які харчувались жирними або контрольними дієтами чау, 10 залишається незрозумілим, чи є спонтанне пересування оптимальною моделлю для дослідження вагового навантаження на скелет плеча . Щоб вивчити, як рівень активності впливає на якість плечової кістки, майбутні дослідження, можливо, захочуть використовувати поведінкові тести, які більше зосереджені на активності верхніх кінцівок, таких як вертикальне сходження. 50

Ці мінімальні ефекти дієти та ожиріння на структуру хряща підтверджувались результатами того, що наші дієти з високим вмістом жиру не змінювали механічних властивостей PCM та ECM. Раніше ми демонстрували, що зміни як модуля ECM, так і PCM, а також зміна градієнта механічних властивостей від PCM до ECM відображають деградацію матриці в ОА, особливо поблизу окремих хондроцитів. 28 Хоча ці висновки свідчать про те, що плече не є легко сприйнятливим до ожиріння ОА, відсутність змін макро- або мікромасштабу хряща може бути пов’язана з іншими факторами. Наприклад, такі зміни можуть відбуватися довше, ніж 24 тижні на дієті з високим вмістом жиру, і часовий масштаб прогресування захворювання, а також ступінь ураження можуть бути специфічними для суглобів.

Підводячи підсумок, ми спостерігали ряд специфічних для дієти змін кісток через ожиріння, тоді як структура хряща та механічні властивості залишалися відносно незмінними. Дослідження показали специфічні для суглобів відмінності у відповіді на ОА, пов’язану з ожирінням, причому кореляція спостерігається у ОА колінного суглоба та кисті, але з незначною або відсутністю кореляції ОА стегна та плеча. 21 Незважаючи на порівняно рідкісну літературу про ОА плеча, наші результати узгоджуються з відсутністю клінічних доказів ожиріння як фактора ризику ОА плеча, але вказують на те, що основні зміни кісток відбуваються в цій моделі. Це дослідження закладає основи для кращого розуміння патогенезу ОА плеча, а також зв'язку між ожирінням та змінами в опорно-руховій тканині плеча. Ця робота надає додаткові обґрунтування для вивчення ролі ожиріння та дієтичного втручання у здоров’ї опорно-рухового апарату, включаючи інші суглоби, такі як плечові, крім колінного та кульшового суглобів.

ВНОСИ АВТОРІВ

LV та FG розробили концепцію та розробили експерименти. Л. В. проводила експерименти. LV, AGS, NSH та CLW аналізували дані. Л. В. написав рукопис. Усі автори прочитали та схвалили остаточно поданий рукопис.

ПОДЯКИ

Автори дякують Сарі Освальд за надання технічної підтримки рукопису та доктору Келсі Коллінзу за обговорення та допомогу у спільному оцінюванні. Це дослідження було частково підтримано грантами NIH AR073752, AR50245, AR48852, AG15768, AR48182, AG46927, AR073752, OD10707, AR060719, Центром опорно-рухового апарату Університету Вашингтона (NIH P30 AR057235), Фондом артриту та Фондом Ненсі Тейлор Хвороби.