Високочутливі мікрорідкі калориметри для біологічних та хімічних застосувань

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Відредаговано Джорджем М. Уайтсайдом, Гарвардський університет, Кембридж, Массачусетс, та затверджено 22 липня 2009 р. (Отримано на огляд 9 лютого 2009 р.)

Ця стаття має виправлення. Дивіться:

Анотація

Флюїдні калориметри надають можливість повністю характеризувати термодинаміку хімічних процесів без маркування або іммобілізації аналіту. Ця гнучкість широко використовується для вивчення біомолекулярних взаємодій, внутрішньомолекулярних структурних змін та кінетики ферментів (1–3). Однак протоколи вимірювання з існуючими калориметрами передбачають порівняно великі обсяги зразків, як правило, в масштабі сотні мікролітрів, і тривалий час вимірювання, як правило, порядку десятків хвилин.

Зростає потреба у високопродуктивних малих об’ємах текучих калориметрів як для фундаментальних наукових досліджень, так і для застосування в техніці. Останні події в мікровиробництві тепер дозволяють будувати «мікросхеми калориметрів», здатні вимірювати обсяги, починаючи від мікролітра і закінчуючи десятками шкали піколітрів (4–14). У майбутньому масштабування операцій на основі масивів дозволить забезпечити високу пропускну здатність вимірювань із зменшеними обсягами зразків, необхідними для того, щоб зробити калориметричний скринінг великих бібліотек аналіту економічно вигідним. Незважаючи на те, що існуючі калориметри чіпів припускають можливість таких майбутніх можливостей, практичному розвитку та впровадженню цієї технології заважають низька чутливість пристрою та відсутність надійної обробки зразків до обсягів піколітрів.

Чіп-калориметри можна класифікувати на дві категорії відповідно до конфігурації їх вимірювальних/реакційних камер. Відкриті камерні мікросхеми калориметри будуються за допомогою термоізольованих свердловин або платформ, на яких зразки помічаються у вигляді крапель за допомогою мікропіпетки або струменевого друку (4–10). Закритокамерні мікросхеми калориметри, навпаки, використовують мікрофлюїдні канали для доступу до закритих вимірювальних камер, в які вводять зразки та контролюють реакції (11–14). Хоча відкриті камерні мікросхеми калориметри забезпечують досить хорошу теплову ізоляцію, вони, як правило, страждають від критичних обмежень, що виникають внаслідок випаровування та незручності при обробці зразків. Це може легко призвести до помилкових вимірювань. З іншого боку, калориметри з мікросхемою із закритою камерою, як правило, мають більшу теплопровідність до свого оточення порівняно з конструкціями з відкритими камерами. Це може призвести до значних втрат тепла, що, в свою чергу, може обмежити чутливість пристрою. Крім того, їх чутливість зазвичай страждає від більшої теплоємності пристрою, ніж загальна для пристроїв з відкритою камерою.

Тут ми повідомляємо про виготовлення та експлуатацію калориметрів із закритою камерою на основі мікрочіпів на основі нової конфігурації, що забезпечує значно підвищену чутливість. Ми вбудовуємо калориметр у тонкоплівкову мікрофлюїдну систему парилену, яка теплоізольована від навколишнього середовища за допомогою вакуумної інкапсуляції на чіпі. Обробка зразків при 1 нл і нижче забезпечується взаємодією цих калориметрів з м’якими пневматичними мікрожидкостями (клапанами, насосами та проточними каналами) для легкого та точного контролю реакції. Цю технологію можна легко масштабувати до архітектур масивів, здатних проводити високопродуктивні калориметричні аналізи для широкого спектру застосувань у хімії, науках про життя та медицині.

Результати і обговорення

Розроблені нами калориметри складаються з трьох основних компонентів: мікрожидкості, термоелектрики та вакуумної інкапсуляції (рис. 1 та 2). Мікрофлюїдики включають вимірювальну камеру, проточні канали та пневматичні компоненти регулювання потоку, що включають клапани та насоси. В мікрорідку камеру вбудовані термопілоти для місцевого вимірювання температури. Мікрофлюїдні канали та вимірювальна камера укладені у вакуумну інкапсуляцію (рис. 1 B та C).

Мікрофлюїдний калориметричний мікросхема на основі парилен-полімеру. (A) Мікросхема пристрою (3 × 3 см), встановлена на вакуумному патроні. Відображаються провідники датчика (ліворуч) і мікрожидкостна трубка управління PDMS (справа). (B) Пристрій (схема поперечного перерізу). Париленову мембрану підвішують і термічно ізолюють за допомогою вакууму. (C) Оптично-мікроскопічне зображення області вимірювальної камери мікросхеми, включаючи межі вакуумного простору на мікросхемі. Вакуумна евакуація відбувається через фіолетовий отвір, видимий у верхньому лівому куті. (D) Мікрофлюїди парилену, термопіла та нагрівач на мембрані парилену (квадрат ≈1,5 мм). Термопіла має звивисту форму для збільшення її поздовжнього теплового опору. Підвішена париленова мембрана прозора; його червонуватий колір виникає головним чином від відбиття світла. (E) Збільшений вигляд вимірювальної камери парилену 3,5 нл (діаметр 200 мкм) та сполучних каналів (шириною 35 мкм), оточених вакуумом. Реакційна камера злегка набрякає через різницю тисків (порівняно з D), коли вакуумну камеру евакуюють.

Мікрофлюїдний макет. Пневматично керований мікрофлюїдний мікросхем PDMS поєднаний з мікрофлюїдними парилінами на мікросхемі калориметра. Шар управління PDMS (червоний) містить клапани та перистальтичні насоси. Шар потоку PDMS (синій) підключений до париленового каналу (чорний) через SU-8 через. У правому верхньому куті вбудовані чотири насоси для впорскування (містять клапани великої площі).

Основні компоненти калориметра, включаючи вимірювальну камеру та термометр, побудовані на тонкій прозорій полімерній мембрані парилен-С, як показано на рис. 1D. Парилен-С, який входить до складу поліксиліленової полімерної серії, використовується як конструкційний матеріал цієї мембрани та основні мікрофлюїдні компоненти. У цьому пристрої вони складаються з чотирьох каналів та реакційно-вимірювальної камери. Камера розташована в центрі мембрани і з'єднується з текучими каналами, що використовуються для ін'єкції та продувки зразка. У типовому протоколі вимірювання два різні розчини зразків вводяться в камеру з двох окремих каналів. Після вимірювання буферний розчин з третього каналу промиває камеру, а його вміст евакуюється через четвертий канал.

Розробляючи калориметр на основі мікросхем, є критичним і складним завданням розробити невелику теплову потужність пристрою порівняно з потужністю самого зразка. Унікальне парофазне осадження парилену дозволяє йому утворювати дуже тонкі конформні шари. Мікрофлюїдні структури парилену в нашому пристрої мають товщину стінок ≈2 мкм, що дозволяє дуже істотно зменшити теплоємність пристрою порівняно з попередньою реалізацією калориметра із закритим чіпом. Парилен також є чудовим ізолюючим матеріалом, що забезпечує суттєве додаткове поліпшення теплоізоляції калориметричної камери.

Наша архітектура пристрою дозволяє регулювати об’єм впорскування зразка шляхом послідовного закриття чотирьох сусідніх клапанів PDMS для полегшення перистальтичної накачки. Кожен клапан дозволяє відтворювати впорскування 700-пл текучого об'єму з точністю ≈50-пл. Загальний робочий протокол калориметра можна легко модифікувати, замінивши мікрофлюїдну систему PDMS на різні альтернативні конструкції. Мікрофлюїдний інтерфейс PDMS-до парилену забезпечує легку інтеграцію функцій калориметра з іншими формами лабораторних приладів.

Низька теплопровідність парилену значно зменшує втрати тепла в наших пристроях до рівня, порівнянного з рівнем найкращих відкритих камерних калориметрів, продемонстрованих на сьогоднішній день. Ми отримали подальше посилення теплової ізоляції реакційної камери за допомогою комбінації вакуумної інкапсуляції на і поза мікросхеми (рис. 1 B і C). Ця конфігурація виявляється вирішальною для досягнення максимальної чутливості в закритих камерах пристроїв на основі чіпів, враховуючи їх високе відношення поверхні до об'єму. Справді, для представлених тут пристроїв з париленом> 90% втрат тепла при навколишньому тиску відбувається через повітря. Парилен має дуже низьку газопроникність і високу механічну міцність, і ці властивості дозволяють нам застосовувати вакуум на тонких мікрожидкостних стінках. У таблиці 1 наведено порівняння теплопровідності наших вакуумно-капсульованих париленових закритих калориметрів із сучасними відкритими та закритими калориметрами на основі чіпів.

Калориметри на основі чіпів та комерційні

Вакуумне капсулювання складається з двох областей. Область над париленовою мембраною (вакуумний простір на чіпі) визначається боковими стінками SU-8 і верхнім скляним покривним склом, герметизованим до калориметра епоксидною смолою, що отверждается ультрафіолетом. Скляна кришка полегшує оптичне зображення калориметричної камери та її вмісту (рис. 1B). Структура SU-8 виконана з малюнком для досягнення як планаризації, так і вакуумної інкапсуляції за один крок. Область під париленовою мембраною (простір вакууму поза мікросхемою) ущільнюється звичайно невеликим ущільнювальним кільцем у спеціальному вакуумному патроні. Два вакуумних простору пов'язані насосним отвором, висітим через пластину, як показано на рис. 1С.

Окремі елементи термопари утворені з мікропереходів Au – Ni. Цей вибір матеріалів забезпечує як зручність виготовлення, так і дуже низький 1/f електричний шум. Ми передбачаємо, що заміна наших термоелементів Au/Ni попередньо продемонстрованими термоелементами, що забезпечують більш високий загальний коефіцієнт Зеебека, повинна легко забезпечити покращення чутливості на порядок більше ніж досягнуте тут (19).

Теплова характеристика пристрою. (А) Термовідповідь на місцевий електричний нагрівач. Поступова функція електричної потужності (4,0 мкВт) застосовується, починаючи з t = 0. Підтримується вакуум 2 мторр, і реакційна камера пристрою заповнюється водою. (B) Моделювання теплової реакції при генерації тепла всередині камери при 1 мкВт. Вимірювальна камера - це коло. Шість ліній розвороту - це металеві датчики, а чотири прямокутники - текучі канали. (C) Експериментальні дані теплопровідності, G, пристрою під вакуумом при різних тисках. Формула припасування G (p) = Gres + Gair/(1 +), де p - тиск вакуумної камери (в торр). Параметри підгонки - залишкова теплопровідність (спричинена париленом тощо) Gres = 15,5 мкВт/К, теплопровідність повітря при 1 атм Gair = 214 мкВт/К та геометричний коефіцієнт d = 170 мкм. Геометричний коефіцієнт d пов'язаний з товщиною вакуумної сорочки та розмірами вимірювальної камери.

Під час цих калібрувань та всіх інших проведених вимірювань у коробці зберігали температуру 20 ° C з довгостроковою стабільністю температури 0,5 ° C (під час сеансів вимірювання ≈1 год). Коливання температури навколишнього середовища незначно впливають на точність наших вимірювань через безпосередню близькість двох кінців термопари (≈1 мм); термопілони відчувають лише градієнт температури між двома своїми кінцями. Крім того, кінці термоелементів ізолюються від навколишнього середовища вакуумним простором. Для встановлення заданої температури реакції калориметр та його текучий вміст підтримують у терморегульованому корпусі під контролем пропорційно-інтегрального похідного.

Калориметрична сигнатура гідролізу сечовини уреазою. Калориметрична реакція після введення різних об'ємних аликвот 50 мМ розчину сечовини в камеру, попередньо заповнену розчином уреази. Для порівняння на одному графіку побудовано чотири окремі вимірювання. (Врізка) Загальна енергія реакції. Червона лінія показує очікувану енергію реакцій, виведених із теплоти реакції, ΔH = 61 кДж/моль.

У цих вимірах загальний шум на виході підсилювача зчитування, згаданий на вході (температурний діапазон), відповідав ≈500 мкК для поточного пристрою (1: 1 SNR; пропускна здатність, 0,01–10 Гц). Домінуючий внесок шуму виник від самого підсилювача зчитування; вторинний внесок виник від шуму Джонсона термоелемента. Внесок від теплових коливань калориметра був ще меншим; ми підрахували, що вони мають порядок 10 мкК в межах смуги вимірювань. На практиці, однак, наша точність вимірювання не наближається до значення чутливості, обмеженого підсилювачем, через різницю обсягів впорскування від циклу до циклу. Для досягнення повної продуктивності цих пристроїв буде потрібно більш точний метод введення зразка.

Ентальпія вимірювання змішування. (А) Тепло розведення метанолу. Загалом 1,4 нл 14,7% розчину метанол-вода змішували з 2,1 нл води. (B) Візуалізація процесу дифузійного змішування, що забезпечується впорскуванням червоного барвника в камеру, заповнену водою.

Розроблена в цій роботі вакуумоізольована мікрорідка реакційна камера застосовується до різноманітних добре перевірених підходів у калориметрії, включаючи ізотермічну титруючу калориметрію, диференціальну скануючу калориметрію та проточну калориметрію. На рис. 6 ми продемонстрували одну з можливих конфігурацій, яку ми розробили для забезпечення потокової калориметрії. Два мікрожидкостних канали, кожен ізольований на підвішеній париленовій мембрані, проходять через два кінці термопіли. Ця диференціальна конфігурація дозволяє придушити текучі неідеальності, такі як розведення та перемішування. Подальше поліпшення чутливості повинно бути досягнуте за допомогою використання термоелектричних матеріалів з вищими коефіцієнтами Зеебека та оптимізації геометрії суспензії парилену для подальшого придушення залишкових теплових втрат в умовах вакууму.

Мікромасштабний калориметр. (A) Мікрофлюїди париліну та електронний датчик, виготовлені на конструкції моста парилену. Вимірювальна камера розташована посередині мосту. (B) Поточний калориметричний чіп (3 × 3 см) з двома однаковими вимірювальними камерами (розташованими в прозорій зоні в центрі) для диференціальних вимірювань.

Резюме

Мініатюризація приносить суттєві переваги калориметрії, включаючи можливість високочутливого, високопродуктивного аналізу при низькому споживанні зразків. Минулі зусилля з розробки мініатюризованих калориметричних датчиків призвели до швидшої реакції (кращої часової роздільної здатності), але, як правило, страждають від низької чутливості до енергії, спричиненої поганою тепловою ізоляцією. Це виявилося особливо шкідливим для мініатюризованих калориметрів із закритою камерою. У цій роботі ми вирішили цю проблему, включивши ізолюючі мікрофлюїди, що мінімізують втрати тепла та підвищують чутливість калориметра. За допомогою цих пристроїв першого покоління ми демонструємо чутливість ≈4,2-нВт і час відгуку ≈1,3-с при загальному обсязі зразка 3,5 нл. Це покращення продуктивності має забезпечити новий клас економічно ефективних, високопродуктивних, автоматизованих калориметричних вимірювань.

Методи

Кілька етапів травлення виконуються за допомогою RIE. Спочатку ділянки розкриття мікрофлюїдного каналу парилену травляться за допомогою плазми O2 під тиском 150 мторр при потужності приводу 140 Вт. Фоторезист всередині каналу видаляється за допомогою метилового ефіру ацетату пропіленгліколю. Після очищення мікрорідких каналів травиться парилен, що покриває електричні компоненти (умови, як зазначено вище). Нарешті, париленову мембрану підвішують, витравлюючи жертвенну мембрану SiN з її тильної сторони; для цього кроку використовується плазма CF4 при тиску 120 мторр з потужністю приводу 140 Вт. Для приладів проточної калориметрії робиться додатковий етап протравлення парилену для моделювання підвісних мостів парилену. Останній етап включає герметизацію області вакуумного капсулювання склом за допомогою отверджуваного ультрафіолетовим випромінюванням клею.

Виноски

1 Кому слід адресувати листування. Електронна пошта: roukescaltech.edu

Внески авторів: W.L., W.F. та M.L.R. розроблені дослідження; В.Л. виконані дослідження; B.W.A. внесли нові реагенти/аналітичні інструменти; W.L., W.F., B.W.A. та M.L.R. проаналізовані дані; та W.L., W.F., B.W.A. та M.L.R. написав роботу.

Автори не заявляють конфлікту інтересів.