Синтез РНК флавівірусу in vitro

Радхакрішнан Падманабхан

1 Кафедра мікробіології та імунології, Медичний факультет Університету Джорджтауна, Вашингтон, округ Колумбія, 20057

Ратрі Тахампуня

1 Кафедра мікробіології та імунології Медичної школи Університету Джорджтауна, Вашингтон, округ Колумбія, 20057

Тадахіса Терамото

Кюнг Х. Чой

2 Кафедра біохімії та молекулярної біології Медичного відділення Техаського університету, Галвестон, Техас 77555-0156

Резюме

Створення систем in vitro для вивчення механізмів синтезу РНК для вірусів з позитивною ланцюгом РНК було дуже корисним у минулому і пролило світло на склад білків та компонентів РНК, оптимальні умови, природу продуктів, що утворюються, цис-діючу РНК елементи та транс-діючі білкові фактори, необхідні для ефективного синтезу. У цьому огляді ми узагальнюємо наше сучасне розуміння щодо вимог до синтезу РНК флавівірусу in vitro. Ми описуємо деталі умов реакції, специфіку матриці, що використовується або багатокомпонентним мембранно-зв’язаним комплексом вірусної реплікази, або очищеною, рекомбінантною РНК-залежною РНК-полімеразою. Ми також обговорюємо перспективи майбутнього, щоб розширити межі наших знань.

1. Вступ

1.1. РНК ДЕНВ

2. Синтез РНК in vitro за допомогою ендогенних вірусних шаблонів РНК у зв’язаних з мембраною комплексах реплікації

2.1. Вступ

Флавівіруси мають широкий діапазон господарів і можуть розмножуватися в різних клітинах ссавців та комарів. Повідомлялося, що хоча альфавірус, вірус Sindbis, може розмножуватися та продукувати вірусоспецифічні антигени в клітинах енюклейованих курячих ембіо, вірус японського енцефаліту (JEV) не зміг цього продукувати, і ядерна участь протягом принаймні 2–4 години після зараження потрібен був синтез антигену, специфічного для вірусу [38]. Роль ядра для цієї вимоги не зрозуміла.

Мембрани ендоплазматичного ретикулуму (ER) безпосередньо беруть участь у трансляції та реплікації вірусів у цитоплазмі. Насправді дослідження з використанням електронної мікроскопії та тривимірних методів електронної томографії показали, що реплікація вірусу відбувається у зв’язаних з мембраною комплексах реплікації в індукованих вірусом та розширених мембранних відділеннях ER [39, 40]. Комплекси реплікації, зв’язані з мембраною, із заражених флавівірусом клітин аналізували на склад вірусних видів РНК за кількома групами. РНК розміром генома 40–44S має ковпачок типу 1 на 5′-кінці, але не має полі (А) на 3′-кінці [1, 41–44]. Крім того, також спостерігалися дволанцюгові РНК 20–22S та гетерогенні 20–28S РНК, імовірно реплікативна форма (RF) та реплікативні проміжні продукти (RI) [45–48], а також менші РНК 8–12S РНК у флавівірусі -інфіковані клітини [1]. Було зроблено висновок, що цей малий вид РНК був продуктами деградації вірусних РНК [49], оскільки повідомлялося, що в попередньому дослідженні не було доказів активності малих РНК у формі [1]. У світлі сучасних знань, малі види РНК, ймовірно, можуть включати субгеномну РНК, яка, як повідомляється, є неповною деградацією вірусної геномної РНК клітинними РНКазами [50]. Було показано, що ця невелика РНК має важливе значення для цитопатичності та патогенності WNV [50, 51].

2.2. Ранні системи для вивчення реплікації вірусів in vitro

Ідея про те, що клітинні мембрани відігравали важливу роль у (+) життєвому циклі вірусу РНК, включаючи реплікацію, була відома принаймні з кінця 1960-х до початку 1970-х [52, 53]. Наприклад, синтез пікорнавірусної РНК ініціюється гладкою мембранною фракцією із значенням седиментації 130 S при градієнтному градієнтному ізофікному сахарозі, яке потім дозріває до комплексу пізньої реплікації з 250 S-структур. Комплекс реплікації складався з вірусної РНК-полімерази, ssRNA, реплікативної форми 20 S та 26 S (RF) та реплікативної проміжної (RI) форми вірусної РНК відповідно [53, 54]. У попередніх дослідженнях ендогенний мембранно-реплікаційний комплекс був охарактеризований при синтезі вірусної РНК Куреші та Трент з використанням клітин BHK-21, інфікованих вірусом енцефаліту Сент-Луї (SLE) [55], та Zebovitz et al. з використанням інфікованих JEV клітин свинячих нирок, PS (Y-15) [47, 48]. Для характеристики видів РНК у цитоплазматичних мембранних структурах, що осідають при 250 S, інфіковані SLE клітини BHK-21 у присутності актиноміцину маркували пульсом міченим [3 H] уридином протягом 30 хв через 16 год після зараження [ 55]. Мембранні структури 250 S, які містили

15% загальної РНК були стабільно пов'язані з мембранами під час виділення градієнтами щільності сахарози, що містять ЕДТА (20 мМ). Ідентифіковано три види РНК; найбільшим був РНКазочутливий, 43 S, потомство ssRNA, потім частково чутливий до RNase, 26 S, і РНКазостійкий, 20 S РНК [55]. Полімеразна активність градієнтних фракцій вимірювалася за допомогою [3 H] GTP у продуктах, мічених кислотою, що осаджується. Обробка екстрактів дезоксихолатом натрію (DOC) та Brij-58 інактивувала ферментну активність. Активність полімерази залежала від Mg +2 та 4 NTP, але пригнічувалась Mn +2 та RNase. Активність ферменту протягом години була лінійною і згодом знижувалась [55].

У дослідженні, описаному Zebovitz et al. [47], цитоплазматичні мембрани готували шляхом лізису гіпотонічної суспензії інфікованих JEV клітин PS (Y-15) і центрифугували при 1000 х g. Залишилася ядерна фракція широко промивалась для усунення цитоплазматичного забруднення [56]. Ядерну фракцію піддавали гомогенізації Дунса для ресуспендування в 2,3 М сахарозі, що містить 1,5 х 10-3 М CaCl2 і 10 мМ трис-HCl буфері, рН 7,5. Суспензію центрифугували при 35000 х g протягом 30 хв. Гранули ядер промивали 3-4 обсягами 0,23 М сахарози, що містять 3 x 10 −3 M CaCl2, і центрифугували при 600 x g протягом 5 хв. Ядра набухали протягом 30 хв у 10 обсягах 2 х 10 -2 М фосфатного буфера, рН 7,2, і піддавали гомогенізації Дунса [56]. Ядерну суспензію центрифугували при 600 х г для видалення цілих ядер та залишків ядер. Суспензію фракції ядерної оболонки центрифугували при 47000 х g протягом 20 хв.

Фракції мембрани цитоплазми та оболонки ядерної оболонки, приготовані з неінфікованих та інфікованих JEV клітин PS (Y-15), через 40 год після зараження аналізували в аналізі RdRp наступним чином. Реакційна суміш складалася з 10 мМ трис-HCl (рН 8,2), 50 мкМ фосфоенолпірувату натрію, 4 мкМ ацетату магнію, по 5 мкМ немеченого АТФ, СТР та UTP, 1 мкКі [3 H] GTP та 0,5 мл клітини -мембранна суспензія з інфікованих та неінфікованих клітин. Реакційні суміші інкубували протягом 30 хв при 37 ° С. Продукти РНК аналізували за допомогою градієнтів щільності сахарози. Основними видами РНК, що утворилися в реакції in vitro, були РНКазостійкі 20S види РНК, що продукуються мембранними фракціями із заражених JEV клітин. Фракція мембрани ядерної оболонки із заражених клітин містила у 1,7 - 4,3 рази вищі рівні активності вірусної РНК-полімерази, ніж фракція мембрани цитоплазми [48]. Метод центрифугування з градієнтом щільності сахарози, обраний для фракціонування продуктів видів РНК, синтезованих in vitro вірусною полімеразою, не мав дозволу і був громіздким для проведення детальних аналізів.

2.3. Системи Westaway та Brinton

Групи Westaway та Brinton розробили системи реплікації РНК in vitro для вивчення синтезу РНК флавівірусу ([57–61]; огляд див. [62] та посилання на них). Протоколи, що використовуються цими двома групами, з деталями модифікацій та вдосконалень їхніх систем наведені нижче.

2.3.1. Протокол щодо виділення комплексу реплікації вірусу Куньцзінь (KUN) (система Westaway)

2.3.1.1. Приготування цитоплазматичних та ядерних екстрактів із заражених KUN клітин Vero

Клітини Vero заражали вірусом KUN (штам MRM61C) для виділення цитоплазматичного мембранного комплексу реплікації [57]. Екстракти готувались у різний час після зараження, як описано [63]. Коротко кажучи, гранульовані клітини ресуспендували в 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ацетату натрію (2,5 х 107 клітин/мл). Клітини порушувались шляхом пропускання 20 х через голку шприца 20 калібру, а потім 20 х через голку шприца 26 калібру. Суспензію клітин центрифугували при 800 х g протягом 7 хв. Ядерну гранулу промивали тим же буфером трис-HCl/ацетат натрію при 1 x 10 8 клітин/мл і центрифугували при 800 x g. Об'єднані супернатантні фракції від двох центрифугувань розподіляли і зберігали при -70 ° C у вигляді цитоплазматичної фракції. Фракцію ядерних гранул ресуспендували в тому самому буфері, як згадано вище, при 2 х 10 7 клітин/мл, центрифугували при 500 х г для освітлення супернатанту і зберігали в аліквотах як ядерний матеріал при -70 ° С. Фракції зберігали ферментну активність більше 12 місяців [58].

2.3.1.2. Аналіз RdRp та аналіз продуктів РНК, що утворюються in vitro

10% від загальної суми; [64]). Ця модель не враховує механізми, що беруть участь у початковому синтезі (-) ланцюгової РНК комплексом вірусної реплікази, але забезпечує молекулярну основу для ролі рециркуляції ВЧ та відносно високу стійкість до РНКази та повільний розпад РІ [57].

2.3.2. Протокол для виділення мембранно-реплікаційного комплексу WNV в системі Брінтона

2.3.2.1. Отримання цитоплазматичної та ядерної фракцій зовнішньої мембрани (S1 та S1) з інфікованих WNV клітин BHK-21

2.3.2.2. Аналіз RdRp

Таблиця 1

Умови реакції на активність WdV RdRp in vitro §