Межі в мікробіології

Харчова мікробіологія

Редаговано

Бальтасар Майо

Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Іспанія

Переглянуто

Анна Ріле

Інститут харчових наук, Національна наукова рада (CNR), Італія

Чжихонг Сонце

Ключова лабораторія молочних біотехнологій та техніки Міністерства освіти, Сільськогосподарський університет Внутрішньої Монголії, Китай

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

Завантажити статтю
- Завантажте PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Додаткові
  Матеріал
Експортне посилання
- EndNote
- Довідковий менеджер
- Простий текстовий файл
- BibTex

ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

UMR GMPA, AgroParisTech, INRA, Університет Париж-Сакла, Тіверваль-Гриньйон, Франція

Вступ

Протягом останніх кількох років кілька досліджень продемонстрували доцільність та переваги мікробного транскриптомічного аналізу сирів (Lessard et al., 2014; Dugat-Bony et al., 2015; De Filippis et al., 2016; Monnet et al., 2016; Дуру та ін., 2018). Останні технічні досягнення та зниження вартості високопродуктивних технологій секвенування (HTS) тепер дозволяють дослідникам точно фіксувати транскриптоми двох або більше видів, що знаходяться в одній вибірці. Цей відносно новий підхід, відомий як подвійна РНК-послідовність, пропонує більш повну перспективу для розсічення міжвидових взаємодій (Wolf et al., 2018).

Метою цього дослідження було дослідити, шляхом комбінації мікробного, біохімічного та транскриптомічного аналізів, біотичні взаємодії в лабораторних міні-сирах, виготовлених із культурою дозрівання, що складається з трьох мікроорганізмів: D. hansenii, функцією якого є підвищення рН, Brevibacterium aurantiacum і Hafnia alvei. Останні два види здатні виробляти леткі сполуки сірки (VSC) і іноді асоціюються разом у комерційних культурах, що використовуються для виробництва сирів, в яких бажаний високий рівень виробництва ароматичних сполук. B. aurantiacum також часто використовується в культурах, що дозрівають, завдяки здатності виробляти апельсинові пігменти в сирах.

Матеріали і методи

Штами та умови росту

Debaryomyces hansenii 304, B. aurantiacum 8 (6) та H. alvei GB001 були з колекції культур GMPA (INRA, Тіверваль-Гриньйон, Франція). Всі ці штами спочатку були виділені з сирів. Дріжджі D. hansenii вирощували на картопляному бульйоні декстрози (BD Difco TM; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, США), а бактерії вирощували в інфузійному відварі серця мозку (Biokar Diagnostics, Бове, Франція). Перед посівом сирного сиру проводили дві послідовні культури. У першій культурі штами вирощували в аеробних умовах (роторний шейкер при 250 об/хв) при 25 ° C у 50-мл конічних колбах, що містять 10 мл ростового середовища. Після інкубації протягом 48 год 250-мл конічну колбу, що містить 50 мл відповідної середовища, інокулювали 1 мл попередньої культури та інкубували протягом 24 годин у тих же умовах.

Виробництво міні-сирів у лабораторних масштабах

Для того, щоб дослідити біотичні взаємодії в культурі дозрівання, що складається з D. hansenii, B. aurantiacum, і H. alvei, ми порівнювали різні міні-сири, що випускалися, з усією спільнотою, с D. hansenii поодинці, с D. hansenii і H. alvei, і с D. hansenii і B. aurantiacum, дозрівали при 15 ° C протягом 21 або 28 днів. Загалом було досліджено вісім різних біологічних умов (табл. 1). Комбінації, в яких дріжджі опущені, тут не розглядались, оскільки зростання бактерій не відбувся через кислотність сирного сиру (рН = 5,1). Чотири копії сиру (N = 4) проводили для кожного біологічного стану.

Таблиця 1. Видові комбінації, досліджені в цьому дослідженні.

Мікробний аналіз

Кожен міні-сир змішували лопаткою, а потім 0,5 г зразка змішували з 9,5 мл фізіологічної води (9 г/л NaCl). Після гомогенізації змішувачем Ultra-Turrax протягом 1 хв при 20 500 об/хв готували 10-кратні серійні розведення у фізіологічній воді і висівали у двох примірниках на агарові пластини. D. hansenii колонії підраховували на дріжджовому екстракті-глюкозо-левоміцетиновому агарі (Biokar Diagnostics) після 3 днів інкубації при 25 ° C. Колонії бактерій підраховували на агарі для інфузії серця мозку (Biokar Diagnostics), доповненому 50 мг/л амфотерицину (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США), який пригнічує ріст грибків, після 3 днів інкубації при 25 ° С. B. aurantiacum і H. alvei можна диференційовано розраховувати на цьому середовищі через різний колір колоній. Мікробний ріст розраховували як середнє арифметичне всіх біологічних повторностей (N = 4), а істотні відмінності між умовами оцінювали Студентські т-тест. Відсутність забруднення перевіряли шляхом дослідження морфотипів колоній, вирощених на агарових пластинах.

Вимірювання рН та оцінка протеолітичної та ліполітичної активності

Значення рН вимірювали на міні-сирах, які змішували лопаткою. Протеолітичну активність визначали на агарі кальцієвого казеїнату, модифікованому за даними Frazier and Rupp (Merck, Дармштадт, Німеччина) з добавкою 1% (мас./Об.) Сухого знежиреного молока (BD Difco TM). Ліполітичну активність визначали на агарі трибутирину (Sigma-Aldrich) з додаванням 1% (мас./Об.) Трибутирину (Sigma-Aldrich). Десять мікролітрів суспензій клітин при 10 6 КУО/мл у фізіологічній воді (NaCl 9 г/л) плямисто інокулювали на планшети, які потім інкубували при 15 або 25 ° C протягом 21 днів. Протеолітичну та ліполітичну активність оцінювали шляхом формування чіткої зони навколо плям.

Екстракція та аналіз метаболітів за допомогою UHPLC-MS та HPLC-UV

Усі сири заморожували при -20 ° C до вилучення. Процедура вилучення метаболіту була адаптована до методу, описаного раніше Ле Буше та співавт. (2013). Коротко, зразки сиру приблизно 2 г розбавляли у 10 разів (мас./Мас.) У деіонізованій воді (Milli-Q Reagent Grade Water System, Millipore Corporation, Billerica, MA, США). Потім суміш гомогенізували за допомогою блендера Ultra-Turrax протягом 1 хв при 20 500 об/хв і гомогенат центрифугували при 10000 × g протягом 10 хв при 4 ° C. Супернатант відновлювали і центрифугували протягом 30 хв при 8000 × g і 4 ° C на відцентрових фільтрувальних установках з молекулярним відсіканням 10 кДа (Vivaspin 20, Sartorius, Palaiseau, Франція).

Потім фільтрат розбавляли 1% мурашиною кислотою для аналізів UHPLC-MS (UHPLC Ultimate 3000 та HR-MS-Q EXACTIVE, Thermo Fisher Scientific, Франція). Умови UHPLC були такими: метаболіти розділяли на фенільній колонці Hypersil GOLD (довжина = 15 мм, внутрішній діаметр = 2,1 мм, розмір частинок = 3 мкм; Thermo Fisher Scientific, Франція). Тиск на початку градієнта становив 120 бар, а температура колонки 25 ° C. Потік становив 0,25 мл/хв, а розчинниками були D: ацетонітрил (якість ВЕРХ) та B: надчиста вода + нонафторпентанова кислота (3 мМ). Градієнт елюції був таким: 4 хв при 98% B + 2% D, потім від 98% до 2% B в D протягом 6 хв і, нарешті, 2% B і 98% D протягом 3 хв. Об'єм ін'єкції становив 5 мкл, а температура інжектора - 7 ° C. Тривалість одного аналізу становила 14 хв. Мас-спектрометричне виявлення проводили за допомогою квадрупольної орбітрапи з джерелом електророзпилювача, що працював у режимі позитивної іонізації. Повне сканування було отримано з діапазоном сканування 3,7 сканування/сек та діапазоном маси від 50 до 700 мкм. (уніфікована одиниця атомної маси) з роздільною здатністю 70 000. Дані ідентифікували та кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення TraceFinder (Thermo Fisher Scientific) відповідно до калібрувального розчину.

Лактозу, лимонну кислоту, галактозу, молочну кислоту, гліцерин, оцтову кислоту та етанол визначали методом ВЕРХ (Waters S.A.S., Saint-Quentin, Франція). Розділення проводили на колонці Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 мм × 7,8 мм; Bio-Rad, Річмонд, Каліфорнія, США), обладнаній катіонною колоною H1 Micro-Guard (30 мм × 4,6 мм; Bio- Rad) при швидкості потоку елюентів 0,6 мл/хв (насос e2695; Waters SAS) і температурі 35 ° C. В якості елюентів використовували 5 мМ H2SO4. Кількісну оцінку проводили з використанням детектора з коефіцієнтом заломлення 410 (RI) та детектора ультрафіолетового/видимого 2489 (Waters S.A.S.) при 210 нм, із зовнішніми стандартами (Sigma) відомих кількостей комерційно чистих речовин, приготованих у свіжому вигляді у фільтрованій деіонізованій воді. Результати аналізували за допомогою програмного забезпечення EmPOWER (Waters S.A.S.).

Вилучення РНК із зразків сиру, виснаження рРНК та секвенування РНК

Картування проти еталонних геномів

Послідовне читання було зіставлено з відповідною базовою базою даних за допомогою програми вирівнювання короткого читання Bowtie версії 1.2.1.1 (Langmead та ін., 2009) із наступними параметрами: -a -m 1 -бест -страта -v 2 -t -S. Для кожного прочитаного послідовності було дозволено максимум два невідповідності. Довідкові бази даних складалися з кодуючих послідовностей ДНК (CDS) штамів, які були посіяні в міні-сири, за винятком D. hansenii, для яких було проведено картографування геному D. hansenii CBS767. Номери приєднання NCBI BioProject штамів, що використовуються для картографування: PRJEB19868 [B. aurantiacum 8 (6)], PRJEB6257 (H. alvei GB001) та PRJNA13832 (D. hansenii CBS767). Кількість зчитувань, які відображено на еталонних геномах, підраховували за допомогою HTSeq-count версії 0.10.0 (Anders et al., 2015) із наступними параметрами: -s yes -t CDS -i locus_tag -m union. Далі були проаналізовані лише зчитування, які зіставлені з унікальними послідовностями.

Аналіз даних RNA-seq

Послідовність читає, що зіставлені з базами даних CDS були отримані з необробленого набору даних. Дані були відфільтровані для видалення генів із середнім значенням 1. Сирий стор-значення були скориговані для багаторазового тестування за допомогою процедури Бенджаміні-Хохберга (Benjamini and Hochberg, 1995), яка оцінює коефіцієнт помилкових відкриттів. Генні розшифровки з відрегульованими стор 3+/сидерофорові комплекси через зовнішню мембрану грамнегативних бактерій (Andrews et al., 2003). Також спостерігалася нижча експресія частини генів компонентів Fe 3+/сидерофорного типу ABC, але багато з цих генів мали низький рівень експресії, що пояснює, чому спостерігалося лише незначне зниження рівня загальної експресії (кумулятивні показники) . Білок для зберігання заліза виявлений у геномі H. alvei є бактеріоферритин (ЄС 1.16.3.1), який є гемосодержащим білком. Експресія гена бактеріоферитину в H. alvei не був модифікований при спільному культивуванні з B. aurantiacum.

Малюнок 4. Експресія генів, що беруть участь у придбанні заліза в міні-сирах. Рівень експресії для кожного типу гена представляється як сума зчитування послідовності (нормоване щодо кожного виду), яке відображено у відповідних генах. Батончики забарвлюються відповідно до біологічних умов; D21 і D28 відповідають часу відбору проб (день 21 та день відповідно); DH, HA та BA відповідають наявності D. hansenii, H. alvei, і B. aurantiacum, відповідно. Смужки помилок представляють стандартні відхилення (чотири копії сиру).

В D. hansenii, деякі різниці в рівнях експресії генів, що беруть участь у придбанні заліза, спостерігались у восьми біологічних умовах, але загальної закономірності не вдалося розрізнити (Додаткова таблиця S15). Однак на 28 день відбулося значне зниження рівня глобальної експресії цих генів (кумулятивні показники) у міні-сирах, щеплених D. hansenii і H. alvei у порівнянні з міні-сирами, щепленими лише D. hansenii (Малюнок 4).

Метаболізм сірки

Обговорення

Таблиця 4. Можливі біотичні взаємодії між D. hansenii, H. alvei, і B. aurantiacum в міні-сирах.

Наші результати свідчать про це H. alvei може отримати користь від ліполітичної активності B. aurantiacum. Це було отримано з аналізу ліполітичних пластин, геномного аналізу та транскриптомічного аналізу міні-сирів. Дійсно, не було виявлено ліполітичної активності H. alvei на агарі трибутирину, і в його геномі не виявлено гена, що кодує передбачувану секретовану триацилгліцеринову ліпазу. В присутності B. aurantiacum, було сильне регулювання Росії H. alvei гени, що беруть участь в катаболізмі гліцерину, енергетичного субстрату, отриманого в результаті ліполізу тригліцеридів. Таким чином, ми можемо припустити, що зростання H. alvei сприяє гліцерин, що виділяється з тригліцеридів сиру під дією триацилгліцеринової ліпази, що виділяється B. aurantiacum.

Транскриптомічні дані показали, що H. alvei сильно пригнічує експресію генів метаболізму сірки в Росії B. aurantiacum, припускаючи, що наявність H. alvei підвищена доступність амінокислот сірки в Росії B. aurantiacum. Це непросто пояснити, оскільки протеолітична активність не спостерігалась H. alvei. Можна припустити, що за відсутності H. alvei, поганий ріст B. aurantiacum що було наслідком низької доступності заліза, також обмежувало кількість протеаз, що виділяються в сирі, що призводило до низької кількості вільних амінокислот сірки в сирі. Для підтвердження або анулювання цієї гіпотези потрібні додаткові експерименти.

Це дослідження також показало, що гени катаболізму D-галактонату B. aurantiacum і H. alvei виражаються під час їх зростання в сирі. Наскільки нам відомо, присутність D-галактонату в сирах ніколи раніше не досліджувалася. Однак було висловлено гіпотезу, що в деяких сортах сиру ця сполука може бути отримана окисленням залишкової лактози або галактози, а згодом використовується як субстрат росту деякими сирними мікроорганізмами, такими як Glutamicibacter arilaitensis (Monnet et al., 2010). У цьому дослідженні ми змогли виявити галактонат у наших міні-сирах, що підтверджує, що ця сполука може вироблятися деякими сирними мікроорганізмами. Виробництво D-галактонату за допомогою універсальної L-арабінозадегідрогенази (AraDH) з Azospirillum brasilense було продемонстровано в інженерній розробці Кишкова паличка штам (Liu et al., 2014). Цікаво, що геном дріжджів D. hansenii кодує передбачувану арабінозу дегідрогеназу (локусна мітка DEHA2B12980g), що може пояснити вироблення галактонату в сирі цим мікроорганізмом.

Малюнок 7. Запропоновані механізми, що беруть участь у взаємних взаємовідносинах між B. aurantiacum і H. alvei. Зелені лінії позначають процеси, за допомогою яких вид може стимулювати свого партнера.