Проектування, побудова та характеристика нового нановібраційного біореактора та посуду для остеогенезу

Предмети

Анотація

Вступ

Збільшення тривалості життя, або тривалості життя, яке спостерігається в усьому розвиненому світі, є цінним показником прогресу сучасної медицини. Однак менш вимірюваною мірою є якість життя протягом цих додаткових років; це називається охороною здоров'я. Частота травм скелета внаслідок вікових станів, таких як остеопороз та остеоартроз, є одним із таких показників. Таким чином, розробка методів лікування, що призводять до збільшення щільності кісткової тканини або загоєння переломів, є основними мішенями для регенеративного потенціалу мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) 1,2 .

Контрольований остеогенез МСК за допомогою механічної стимуляції був продемонстрований за допомогою декількох методів, включаючи пасивні та активні стратегії. Пасивні методи, такі як змінена топографія підкладки та жорсткість середовища, забезпечують один механізм, заснований на зміні профілю адгезії 3,4,5,6,7, тоді як активні методи включають вплив змін сили із зовнішніх джерел 8,9,10,11,12, 13. Центрифугування, вібрація та зсувний потік забезпечили збільшення остеогенезу завдяки зовнішній модуляції сили, що накладається на клітинну структуру. Досліджено використання вібрації як механотрансдуктивного стимулу з різними вібраційними параметрами 14,15,16. Вібрація стовбурових клітин періодонтальної зв’язки при 50 Гц з піковим прискоренням 0,3 g показали підвищені маркери остеогенезу 17, в той час як інше дослідження стовбурових клітин, отриманих з жирової тканини, стимульоване за допомогою джерела вібрації, керованого зворотним зв'язком, при 50 і 100 Гц з піковим прискоренням 3 g, показали підвищений рівень активності лужної фосфатази (ALP) та відкладення мінеральних речовин, проте не на тому ж рівні, що виробляється остеогенними середовищами 18 .

Початкові дослідження від Кертіса та ін. 19 та Нікукар та ін. 20, проведений з використанням амплітуд вібрацій у десятки нанометрів, показав, що ендотеліальні клітини та МСК чутливі до коливань цього рівня. Для досягнення нанометрових вібрацій у кількох дослідженнях 19,20,21,22 використовувались один п'єзопривід, одиничний апарат чашки Петрі, щоб виробляти точні вертикальні вібрації на невеликій поверхні зростання, однак це накладало обмеження масштабу та амплітуди вібрації, які стають актуальними, якщо розвиватися в напрямку більший промисловий процес. Використання альтернативних контейнерів для росту (e.g. Колби Т-75) та посуд, а також більший діапазон амплітуд (і, отже, клітинні сили), вимагають більш рівномірної, універсальної та багаторазової біореакторної платформи. Початковий прототип біореактора був побудований з урахуванням масиву п'єзозахисних елементів, прикріплених до металевої платформи для багатокважинних культурних виробів, і детально описаний у дослідженні Цимбурі та ін. 23, що стосуються обох цих питань. Метою роботи, представленої в цій статті, є просування цього проекту до системи, сумісної з належною виробничою практикою (GMP), яка підходить для проведення невеликого клінічного випробування.

Нарешті, загальна робота системи біореакторів була підтверджена шляхом біологічного експерименту шляхом кількісної оцінки експресії остеогенного білка MSC, підданих нановібраційній стимуляції. Вимірювання атомно-силової мікроскопії (AFM) також проводили на колагеновому гелі, використовуваному в цих експериментах, щоб визначити, що вібрації передаються від культурального посуду в гель і що жорсткість гелю не суттєво зростає під час нановібрації за допомогою неньютонівського/ефекти деформаційного затвердіння 24 .

Результати

Дизайн вібраційної пластини біореактора з використанням ЗЕД

Конструкція біореактора, зокрема вибір матеріалів, п’єзопозиціонування та кріплення посуду, була розроблена для оптимізації передачі наномасштабної вібрації через смугу частот, що відповідає попереднім нанобрабраційним дослідженням, між 1 Гц та 5 кГц. Загальний підхід полягав у забезпеченні того, щоб резонансні умови верхньої пластини та основи були відповідно вище частоти спрацьовування, щоб запобігти резонансному посиленню/демпфуванню. При дотриманні цієї умови верхня пластина повинна рухатися у вигляді твердого тіла, забезпечуючи постійні та кількісно вимірювані амплітуди вібрації.

Для створення біореакторів економічно вигідним способом було підраховано, що оптимальним буде тринадцять-п’ятнадцять п’єзо, з метою 10-відсоткового варіації переміщень при мінімальній кількості п’єзо. Моделювання гармонічної реакції ЗЕД тринадцяти п'єзорешіток у поперемінних рядах по три та два та п'ятнадцяти п'єзорешіток у рядах по три показало, що тринадцять п'єзорешіток створює найбільш рівномірне зміщення по верхній пластині (рис. 1). У п’ятнадцяти п’єзорешітках усі виконавчі механізми вирівняні, створюючи чергуються лінії п’єзозакріпленої верхньої пластини та вільно плаваючої верхньої пластини. Це утворює різні змінні смуги мінімального та максимального переміщення, що призведе до того, що клітини отримуватимуть невідповідні рівні вібрації в прикріпленому культуральному посуді. Тринадцять п'єзорешіток мають виконавчі механізми, розташовані в шаховому порядку, уникаючи окремих областей з низькою/високою амплітудою вібрації. Більші зміни амплітуди витіснення в основному обмежуються краями, які не є прямими ділянками контакту з прикріпленими багатокважинними пластинами.

Аналіз ЗЕД проводили в робочому середовищі ANSYS 17.1, щоб визначити гармонічну реакцію на частоті 1 кГц на верхніх пластинах тринадцяти та п'ятнадцяти п'єзорешіток. (A) Діаграма тринадцяти п'єзорешіток. (B) Діаграма п’ятнадцяти п’єзорешіток. (C.) Передбачуваний наномасштабний зсув тринадцяти п’єзорешіток на частоті 1 кГц. (D) Прогнозоване зміщення наномасштабу п’ятнадцяти п’єзорешіток на частоті 1 кГц.