Придушення вивільнення ентероендокринних клітин глюкагоноподібного пептиду (GLP) -1 шляхом індукованого жиром малого

Шлункове шунтування при ожирінні Roux-en-Y надає швидкі, не залежні від ваги ефекти на метаболізм глюкози, що не можна пояснити лише періопераційним голодуванням.

Які нові висновки?

Кетогенез кишечника, спричинений тривалим годуванням з високим вмістом жиру, може бути механізмом, що притупляє чутливість GLP-1 у пацієнтів із ожирінням перед операцією. Після шунтування шлунка цей механізм може бути полегшений за рахунок гальмування кишкового кетогенезу, сприяючи швидкому поліпшенню реакції GLP-1 після операції.

Як це може вплинути на клінічну практику в осяжному майбутньому?

Може бути можливо фармацевтично націлити кишковий кетогенез і тим самим протидіяти діабетогенному ефекту ожиріння без необхідності шлункового шунтування.

ВСТУП

Шлунковий шунтування Roux-en-Y (RYGB) ефективний при тривалому лікуванні патологічного ожиріння та діабету типу 2. Втрата ваги сама по собі є важливим фактором поліпшення метаболічного стану, але RYGB також активує ранню післяопераційну, незалежну від ваги механізми, наприклад, індуковане їжею викид пептидів кишечника.2 3 Такі ефекти, пов’язані з RYGB, підкреслюють ефекти анатомічної реконфігурації травного тракту в метаболізмі всього тіла. Тому ми використовували RYGB як модель, щоб спробувати знайти нові кишково-асоційовані механізми в проксимальній частині тонкої кишки для поліпшення метаболізму глюкози.

Матеріали і методи

Хірургія та пацієнти

Додатковий матеріал

Характеристика пацієнта в групах протеоміки, підтвердження та дієти

Аналіз глобальної експресії білка слизової оболонки товстої кишки

Ця методика була описана раніше. 11 Для подальшого аналізу були включені лише білки, які постійно змінювались у всіх пацієнтів і принаймні на 50% від вихідного рівня.

Дослідження на тваринах

Чоловіків мишей C57BL/6J від чотирьох тижнів до 5 тижнів було придбано у Harlan (Horst, Нідерланди). Тварин утримували при контрольованій температурі (23 ° C) та світлі (ввімкнене світло, 06: 30–18: 30 годин), з вільним доступом до води та гранульованої їжі (R34 Lactamin, Kimstad, Швеція) із вмістом поживних речовин у г %: жир 4%, білок 16,5%, вуглеводи 58,0%; загальна калорійність: 3 ккал/г. Починаючи з 6 до 8 тижнів, мишей годували HFD або нежирною дієтою (LFD) протягом 3 тижнів або 3 місяців. HFD складався з гранульованої їжі (Surwit Diabetogenic Dietogen Diet, D12309; Research Diets, New Brunswick, New Jersey, USA) і мав вміст поживних речовин у г%: жир 35,9%, білок 23%, вуглеводи 35,5%; загальна калорійність: 5,6 ккал/г. Тварини з НДН продовжували отримувати звичну дієту (R34).

У першому наборі експериментів мишей забивали через 3 тижні або LFD, або HFD, і різні частини тонкої кишки; дванадцятипала кишка (проксимальна 3 см), тонка кишка (середня 3 см) та клубова кишка (дистальна 3 см), а також печінка. Зразки повної товщини кишкової стінки та однієї частки печінки швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали замороженими (-70 ° C) для подальшого аналізу експресії білка методом Вестерн-блот (див. Нижче).

У другому наборі експериментів мишей годували LFD або HFD протягом 3 місяців. У досліджуваний день їжу виймали протягом 45 хв перед експериментами, щоб синхронізувати стан годування. На початку експерименту було проведено пероральне введення з 250 мкл інтраліпіду (соєва олія 200 мг/мл, очищені фосфоліпіди яєць, гліцерин, гідроксид натрію, вода; Fresenius Kabi, Швеція), що містить будь-який носій (20 мкл етилацетату ), 2,5 мг інгібітора мітохондріального 3-гідрокси-3-метилглутарил-КоА-синтази (mHMGCS) гімеглюзину (Санта Круз Біотехнологія, Санта Круз, Каліфорнія, США; розчинений у транспортному засобі) або 25 мг β-гідроксибутирату (βHB, Sigma- Олдріч, Сент-Луїс, Міссурі; розчинено в транспортному засобі). Через 15, 30 або 120 хв з хвоста відбирали зразки венозної крові та аналізували βHB за допомогою β-кетонового датчика GlucoMen LX (A. Menarini Diagnostics, Firenze, IT).

У третьому наборі експериментів мишей тримали на НЧ або НЧ протягом 3 тижнів і голодували протягом 6 годин до початку експерименту. Потім було проведено оральний зонд 500 мкл інтраліпіду (Fresenius Kabi), і через додаткові 90 хв мишей знеболювали за допомогою ізофлурану. Виконали лапаротомію, ідентифікували та пробили ворітну вену за допомогою тонкої голки та взяли кров. Зразки периферичної крові одночасно брали з ока. Зразки крові центрифугували для приготування сироватки. βHB аналізували в сироватці крові за допомогою набору для аналізу тіла на кетоні EnzyChrom (BioAssay Systems, Hayward, Каліфорнія, США).

Гомогенізація біоптатів, вестерн-блотинг та кількісне визначення βHB

Для всіх когорт людини та всіх зразків слизової оболонки товстої кишки в мишах зразки тканин готували, як описано раніше.11. Для кожної виявленої смуги щільність визначали кількісно і виражали у відсотках від загальної щільності всіх смуг цього конкретного розміру на одному і тому ж мембрана. В якості контролю завантаження використовували гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу (GAPDH). Щодо антитіл див. Додаткову онлайн-таблицю 1.

Додатковий матеріал

Для кількісного визначення βHB аналізували гомогенати тканин per-RYGB та post-RYGB з «дієтичної когорти», використовуючи βHB Colorimetric Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, USA), і результати нормалізували до вмісту гомогенату білка.

Гістологія слизової оболонки товстої кишки

Зразки слизової оболонки товстої кишки, отримані у пацієнтів per-RYGB та post-RYGB (n = 5, випадковий вибір із підтверджуючої когорти), обробляли згідно стандартних процедур для підготовки зразків гістології. Коротко кажучи, біопсії фіксували у фосфатно-забуференному 4% формальдегіді, зневоднювали та вкладали у парафін. Вбудовані біопсії розрізали на ділянки 5 мкм. Для імунофлюоресценції зрізи регідратували, антигени отримували і зрізи блокували у 5% нормальній козячій сироватці (31872, ThermoFisher Scientific, Рокфорд, Іллінойс, США) перед інкубацією з первинними антитілами протягом ночі при 4 ° C. Потім предметні стекла промивали та інкубували з вторинним антитілом протягом 2 годин при кімнатній температурі та протифарбували фарбуванням Hoechst (H6024, Sigma-Aldrich). Щодо антитіл див. Додаткову онлайн-таблицю 1. Зрізи з блокуючим буфером замість первинного антитіла були включені як негативні контролі. Для загальної гістології фарбування H&E проводили за стандартними процедурами.

Первинна культура мишоподібної кишки та кількісна оцінка секреції GLP-1

Залучення пацієнта та громадськості

Громадськість та пацієнти не брали участі у розробці, наборі чи проведенні цього дослідження.

Статистичний аналіз

T-тест Стьюдента був використаний для аналізу статистичних змін рівня білків при протеомічному аналізі інтенсивності плям на двовимірному гель-електрофорезі. Для аналізу даних секреції GLP-1 використовували двосторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) з подальшим тестом Тукі на чесно значущу різницю (HSD). Непараметричний тест Уїлкоксона з підписаним рангом використовували для парних даних людини та непараметричний U-тест Манна-Уїтні для даних неспарених мишей. Всі статистичні дані проводились із використанням Prism 7 та 8 (GraphPad, La Jolla, Каліфорнія, США). Якщо не вказано інше, середнє значення та SEM представлені на рисунках.

Результати

RYGB знижує експресію білка mHMGCS в тонусній кишці

Підтвердження хірургічного зниження рівня mHMGCS слизової оболонки та рівня кетонового тіла

Схематична ілюстрація запропонованого механізму кетонового тіла на GLP-1, що продукує ентероендокринні клітини (ЄЕС). Хронічний вплив вільних жирних кислот (FFA) індукує підвищену експресію mHMGCS та вироблення βHB в епітеліальних клітинах тонкої кишки на кінчиках ворсинок. βHB досягає ЄЕС через венозну мікроциркуляцію ворсинок і діє через FFAR3/GPR41, щоб інгібувати вироблення/вивільнення GLP-1. Операція RYGB може впливати на цей механізм, зменшуючи доступність FFA та експресію mHMGCS. GAPDH, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа; GLP-1, глюкагоноподібний пептид-1; mHMGCS, мітохондріальна 3-гідрокси-3-метилглутарил-КоА-синтаза; RYGB, шлунковий шунтування Roux-en-Y.

Обговорення

Доступно дуже мало звітів про експресію кетогенного ферменту mHMGCS, що обмежує швидкість, у слизовій оболонці тонкої кишки людини16. Ми показуємо, що операція RYGB сама по собі, а не зменшення споживання калорій, призвела до значного зменшення експресії mHMGCS та кетонового тіла кишечника ( βHB) рівні. Причин зниження експресії та виробництва кетонового тіла після операції може бути кілька. Наприклад, знижений ліполіз через відхилення ліпази жовчі та підшлункової залози від аліментарної кінцівки може спричинити недоступність субстрату. Іншою причиною може бути посилене використання ліпідів для анаболічних цілей або окислення ліпідів для енергетичних потреб після гіпертрофії, яка виникає в аліментарній кінцівці тонкої кишки після RYGB.5 17 18

Відомо, що кетонові тіла виробляються в печінці під час голодування або з низьким вмістом вуглеводів кетогенної дієти для забезпечення енергією периферичних тканин, включаючи мозок, коли рівень глюкози низький. Кетогенез асоціюється з короткими жирними кислотами, такими як бутират, які одночасно індукують експресію mHMGCS через PPARα, а також діють як субстрати-попередники шляхом β-окислення.16 Натомість у тонкому кишечнику mHMGCS має вираз, пов’язаний із споживанням їжі. Раніше було показано, що воно сильно виражається у ранньому постнатальному періоді у сисучих гризунів, а голод зменшує свою експресію, на противагу печінковому кетогенезу.19 20 Після відлучення від ЛФД вираз з кишечника зник. -вміст грудного молока, що індукує mHMGCS. Експресія mHMGCS в тонкому кишечнику також може бути відновлена за допомогою дієти з високим вмістом жиру у дорослих гризунів.21 22 Таким чином, кишковий кетогенез може представляти жирово-чутливий механізм слизової оболонки тонкої кишки. Здається цілком імовірним, що це зовсім інший опосередкований поживними речовинами сигнал порівняно із системним кетогенезом, під час якого кетони пропонують діяти як системні сигнальні метаболіти, які можуть захистити від резистентності до інсуліну та діабету типу 2.

В експериментах на тваринах ми підтвердили, що експресія mHMGCS суттєво підвищується в тонкій кишці після годування HFD. Це вираження призводить до підвищення рівня кетонового тіла βHB у портальній крові мишей. Крім того, продукція βHB була повністю заблокована шляхом пероральної попередньої обробки специфічним інгібітором mHMGCS гімеглюзином. Місцеві рівні кетонових тіл у місці продукування, тобто клітин епітелію слизової оболонки та мікроциркуляції ворсин, можуть бути значно вищими (наближеними до наших вимірювань слизової ∼10 мМ), оскільки портальна кров венозною «розбавляється» повернення з інших відділів кишечника, крім тонкої кишки. Потенційним обмеженням нашого дослідження є те, що неможливо було отримати зразки після їжі для вимірювання кетонового тіла у пацієнтів, оперованих RYGB. Нещодавно було показано, що поглинання та окислення жирних кислот після їжі було збільшено (і не зменшено) у щурів, що оперували RYGB18. Чи відображає це компенсаторне збільшення в інших частинах кишечника, залишається дослідити.

Припинення дії інгібуючих кетонових тіл на ЄЕС може сприяти підвищенню реакції кишкового пептиду після операції на RYGB. У культурі клітин на первинних ЕЕС кетонне тіло βHB пригнічувало стимулювання вивільнення глюкози GLP-1 на ~ 40% порівняно з вихідним рівнем. Це інгібування опосередковувалось рецептором, пов'язаним з Gαi, оскільки воно було повністю скасовано за допомогою рецептора-інгібітора Gαi, пов'язаного з PTX. Рецептор FαAR3/GPR41, пов’язаний з тілом/жирною кислотою Gαi, експресується в епітелії тонкої кишки, де він сильно збагачений ЄЕС14. та GLP-1.24 Наші дані свідчать про новий механізм, оскільки зв’язаний з Gαi рецептор-інгібітор PTX блокує супресивний ефект як βHB, так і соматостатину на вивільнення GLP-1 з ЄЕС. Однак ми не могли однозначно зробити висновок, чи інгібуване βHB інгібування секреції GLP-1 опосередковується FFAR3 або альтернативним рецептором Gαi, таким як GPR109a, в ЄЕС. Однак GPR109a виражається набагато нижчим рівнем у ЄЕС15

Підсумовуючи, ми пропонуємо хірургічну фізіологічну реконструкцію аліментарної кінцівки шляхом індукування дефіциту субстрату для кетогенезу. Це може сприяти поясненню дуже швидкого поліпшення секреції гормону інкретину, яке спостерігається після RYGB, як нещодавно ми показали, що це очевидно вже через 2 дні після операції.3 Ці висновки узгоджуються із запропонованим `` антиінкретином '' та `` виключенням передньої кишки '' гіпотези, які можуть пояснити наслідки хірургічного втручання RYGB на поліпшення насичення та гомеостаз глюкози.10 Це може відкрити нові шляхи для розвитку препаратів проти ожиріння та протидіабетичних препаратів, спрямованих на mHMGCS та вироблення кетонів слизової оболонки кишечника, з метою збільшення ЄЕС чуйність та вивільнення пептиду кишечника при стимуляції поживними речовинами.

Подяка

Автори висловлюють подяку професору Клаесу Олссону та Крістіні Валленіус за критичне читання рукопису. Аналіз протеоміки проводили в ядрі Proteomics Core, Академія Sahlgrenska, Університет Гетеборга. Експерименти на тваринах у Гетеборзі проводили у співпраці з Центром фізіології та біовізуалізації (CPI) Академії Салгренської університету в Гетеборзі та в ньому. Імуноаналізи tGLP1 проводили в лабораторії біохімічного аналізу лікарні Адденбрука.