mTORC2 бере участь у індукції фосфорилювання RSK шляхом сироваткового або поживного голодування

Фосфорилювання RSK у місці гідрофобного мотиву зменшується в клітинах, порушених mTORC2. (A) RSK має два збережені каталітичні домени, N-кінцевий (NTKD) та C-кінцевий (CTKD) кіназні домени, які фосфорилюються в кожному з їх циклів активації (T-Loop). Ці два домени фланкують лінкерну область, яка зберігається серед AGC-кіназ, що містять збережений поворот (TM) та гідрофобні мотиви (HM), які фосфорилюються у зазначених ділянках. (B) Дикий тип (WT) або SIN1 -/- MEF вирощували в повному DMEM (базальний; B) або вирощували, а потім голодували сироваткою протягом ночі. Сироватку повторно додавали і клітини інкубували протягом зазначеного часу (хв) перед збором урожаю. Загальні лізати готували з CHAPS, що містить буфер, і піддавали SDS-PAGE та імуноблотингу з використанням зазначених антитіл. (C) Клітини HeLa трансфікували за допомогою контролю скремблювання (scr) або siRNA, націленого на mTOR. Клітини лізували за допомогою RIPA і обробляли, як у В. (D) Тимоцити з диким типом (+/+), гетерозиготною (+/−) або гомозиготною (-/-) делецією риктора лізували і піддавали SDS-PAGE та імуноблотингу. (E) Тимоцити дикого типу (WT) або дефіциту риктору не стимулювали (0) або стимулювали антитілом CD3ε (10 мкг/мл) протягом зазначеного часу (хв).

Активація ERK є важливою, але недостатньою для повного фосфорилювання сайту RSK HM. (A) Клітини HeLa ресуспендували у повному середовищі без сироватки у присутності або відсутності 15 мкМ U2016 протягом зазначеного часу. 1 × FBS (сироватка) додавали, як зазначено, протягом останніх 0,5 год перед збором урожаю. Клітини збирали в буфері лізису CHAPS, а білкові екстракти піддавали SDS-PAGE та імуноблотингу з використанням зазначених антитіл. (B) Дикий тип (WT) або SIN1 -/- MEF вирощували в повному DMEM (базальний; B) або вирощували, а потім голодували сироваткою протягом ночі. Сироватку повторно додавали і клітини інкубували протягом зазначеного часу (хв). Клітини збирали та обробляли, як у (А). (C) WT або SIN1 -/- MEF вирощували протягом ночі за відсутності сироватки з подальшим додаванням сироватки або РМА протягом зазначеного часу. (D) WT або риктор -/- тимоцити не стимулювались (0) або стимулювали анти-CD3 та 10 нг/мл PMA протягом зазначеного часу (хв).

Фосфорилювання на сайті RSK HM підвищується під час виведення поживних речовин. (А - Г). Вирощування HeLa (A - C) або WEF MEF (D) ресуспендували в середовищах з або без 1-кратного діалізованого FBS (dFBS) (або 1 × dFBS, як зазначено в (C, D) і не маючи (-) або містять (+) або глюкоза (A), глутамін (B) або як глюкоза, так і глутамін (C, D) у зазначений час. У (C, D) клітини збирали через 1 год. Клітини лізували буфером RIPA та обробляли на SDS-PAGE (E) Зростаючі клітини ресуспендували в середовищах з dFBS у відсутність або присутність глюкози та/або 500 мкМ 2-дезоксиглюкози (2DG) та інкубували протягом зазначеного часу. (F) Вирощування WT або SIN1 -/- MEFs ресуспендували в середовищах без браку глюкози, глутаміну та/або dFBS або інкубували протягом 1 год перед збором. Клітини збирали та обробляли на SDS-PAGE та імуноблотинг.

Фосфорилювання S6 зменшується, незважаючи на посилене фосфорилювання RSK HM під час виведення поживних речовин. (A) Зростаючі MEF WT ресуспендували у повному середовищі у присутності (+) або відсутності (-) сироватки протягом зазначеного часу. Клітини збирали та обробляли для SDS-PAGE та імуноблотингу. (B, C) Зростаючі WT MEF (B) або HeLa (C) ресуспендували в середовищах з dFBS, не маючи ні глюкози, ні глутаміну, ні глюкози, ні глутаміну, та інкубували протягом зазначеного часу.

Каталітична активність mTOR не потрібна для фосфорилювання сайту RSK HM. (A, B) Зростаючі WT MEF (A) або клітини HeLa (B) додавали або 1 мкМ Torin1, 1 × FBS (сироватка), або обидва, і інкубували протягом зазначеного часу. (C, D) Зростаючі WT MEF ресуспендували в середовищах з dFBS, не маючи (-) або містять) глутаміну (C) або глюкози (D). Torin1 (1 мкМ) або транспортний засіб (-) додавали під час ресуспендування та інкубували у зазначений час.

RSK і SIN1 колокалізуються на плазматичній мембрані. WEF MEFs були ко-трансфіковані GFP-SIN1β та пташиним мутантом HA-RSK-WT або HA-RSK-SA (Ser381 Ala). Через 48 год клітини рестимулювали сироваткою протягом 15 хв. Фарбування та мікроскопію проводили для виявлення GFP, HA, а також DiI (мембрана) та DAPI (ядро).

Субстрат RSK CCTβ має дефектне фосфорилювання та експресію за відсутності mTORC2. (А) Лізати тимоцитів дикого типу (риктор +/+), риктор +/− або риктор -/- смітники розчиняли за допомогою SDS-PAGE та аналізували на фосфорилювання відомих субстратів RSK за допомогою імуноблотингу. (B) Дикий тип (WT) або SIN1 -/- MEF вирощували в повному DMEM (базальний; B) або вирощували, а потім голодували сироваткою протягом ночі. Потім клітини залишали голодними (-) або сировину додавали повторно і клітини інкубували протягом зазначеного часу. (C) WT або SIN1 -/- MEF трансфікували плазмідою Flag-CCTβ або контролем вектора (vec). Клітини голодували і повторно стимулювали сироваткою, як у В. Лізати піддавали імунопреципітації з використанням антитіла Flag. Імунопреципітати фракціонували і блотували для фосфорилювання CCTβ (використовуючи субстрат-антитіло до консенсусного мотиву Phospho-Akt (P-AS)) або Flag. Загальні екстракти (введення) також фракціонували за допомогою SDS-PAGE та імуноблотували для pHM RSK або CCTβ. (*) позначає екзогенний прапор-CCTβ, нижня смуга - ендогенний CCTβ.

Модель регулювання mTORC2 RSK. У відповідь на стимуляцію сироватки/фактора росту або на виведення поживних речовин, фосфорилювання RSK (показано помаранчевим кольором) на гідрофобному мотиві (Ser380), розташованому в області зв’язку між NTKD (зеленим) і CTKD (жовтим), потребує недоторканого mTORC2 але не каталітична активність mTOR. SIN1 асоціюється з РСК на плазматичній мембрані та колокалізується з нею. mTORC2 може служити лісом для посилення фосфорилювання RSK HM, опосередкованого CTKD. CTKD активується ERK. mTORC2 також необхідний для фосфорилювання субстрату RSK CCTβ.