Порівняльна метаболоміка у веганів та всеїдних виявляє обмеження на кишечник, що залежить від дієти

Вживання аграрної дієти на рослинній основі пов’язане з користю для здоров’я.

всеїдних

Дієта змінює склад мікробіоти кишечника і служить субстратом для бактеріального обміну, який може вплинути на здоров'я господаря.

Дані моделей мишей та мікробіоти кишечника у людей, що проживають в аграрних та західних суспільствах, дозволяють припустити, що вплив дієти на склад мікробіоти кишечника великий.

Які нові висновки?

Вплив дієти на метаболом плазми всеїдних та веганів великий, але її вплив на склад мікробіоти кишечника напрочуд скромний.

Метаболіти мікробіоти кишечника більше впливають на метаболом плазми крові веганів, ніж всеїдні.

Виробництво метаболітів, похідних бактерій кишечника, з харчових субстратів обмежується складом мікробіоти кишечника.

Як це може вплинути на клінічну практику в осяжному майбутньому?

Фактори навколишнього середовища, незалежно від дієти, можуть зіграти вирішальну роль у формуванні складу мікробіоти кишечника у різних людських суспільствах, що, в свою чергу, впливає на вироблення таких корисних метаболітів, як коротколанцюгові жирні кислоти та еквол з раціону та мікробіота кишечника.

Розробка пребіотиків для доставки субстратів для мікробіоти кишечника для отримання бажаних метаболітів, які сприятимуть здоров’ю, повинна враховувати склад мікробіоти кишечника.

Вступ

Серед багатьох факторів, що впливають на мікробіоти кишечника, дієті приділяється значна увага через її потенційний вплив на здоров’я. Дослідження з використанням моделей гризунів, обстеження різних видів ссавців та дослідження поперечного перерізу у різних людських популяціях свідчать про те, що дієта сильно впливає на склад мікробіоти кишечника. 1–5 Навпаки, більш помірні дієтичні втручання, які можна підтримувати в люди в довгостроковій перспективі припускають, що вплив дієти може бути більш скромним. 6–8 Довготривале споживання аграрних дієт на рослинній основі було пов’язане з більшим таксономічним та бактеріальним різноманіттям генів, вищими рівнями коротколанцюгового вироблення жирних кислот та більшою кількістю Prevotella/Співвідношення бактероїдів. 2, 6 Кілька захворювань пов'язані зі зменшенням різноманітності мікробіоти кишечника, що є ознакою "дисбіозу" - таким чином, зміна дисбіотичної мікробіоти шляхом модифікації дієти або іншими способами може слугувати підтримці здоров'я та/або лікуванню захворювання.

Дієта забезпечує субстрати для виробництва безлічі малих молекул, які після першого проходження метаболізму в печінці циркулюють систематично, де вони можуть мати різний вплив на фізіологію господаря.9 Наприклад, харчовий холін або карнітин можуть перетворюватися кишечником мікробіоти до триметиламіну, який згодом окислюється в печінці до триметиламіну оксиду, невеликої молекули, пов'язаної з підвищеним ризиком розвитку ішемічної судинної хвороби. 10, 11 При розмірі геному, приблизно в 150 разів більшому, ніж господар ссавців, метаболом кишечника мікробіота дозволяє виробляти безліч дрібних молекул, не продукованих господарем.12 Конкретні вироблені молекули регулюються наявністю субстрату, великою кількістю продукту, активністю мікробних генів та іншими механізмами, про які не можна легко зрозуміти з простої кількісної оцінки кількості мікробних генів. Таким чином, таксономічна інформація мікробіоти кишечника або навіть аналіз цілого геному може бути недостатньою для прогнозування метаболомів складної мікробної спільноти.

Матеріали і методи

Людські предмети

Критерії виключення були раніше описані для нашого дослідження поперечного перерізу серед веганів та всеїдних тварин та експерименту з поздовжнім контрольованим годуванням (CAFÉ) серед всеїдних тварин.6 Дослідження поперечного перерізу включало 15 новобраних веганів та шість всеїдних та вихідні дані 10 всеїдних включено до CAFÉ.6. Вегани споживали веганську дієту мінімум 6 місяців. Кожен учасник здійснив три 24-годинні дієтичні відкликання протягом 1 тижня, як описано раніше6, після чого були відібрані зразки крові та сечі у фекаліях, натщесерце.

Секвенування генів 16S рРНК та метаболоміка плазми

ДНК виділяли зі стільця, як описано в посиланнях. 6 і 13. Бактеріальні послідовності генів 16S рРНК ампліфікували ПЛР за допомогою праймерів, що зв’язуються з областю V1V26, 13 за допомогою штрих-кодованих праймерів. 14, 15 Читання послідовностей контролювали якість та аналізували за допомогою конвеєра QIIME із параметрами за замовчуванням. вилучено та проаналізовано на рідинній хроматографії/мас-спектрометрії (LC/MS), LC/MS/MS та газовій хроматографії (GC)/MS на платформах Metabolon (Дарем, Північна Кароліна, США).

Аналізи білка плазми

Глюкозу в плазмі, холестерин, ліпопротеїни високої щільності (ЛПВЩ) та тригліцериди визначали на COBAS c501 (Рош, Індіанаполіс, Індіана, США); розрахунковий ліпопротеїн низької щільності (ЛПНЩ) розраховували за допомогою рівняння (ЛПНЩ = загальний холестерин - холестерин ЛПВЩ - (тригліцериди ÷ 5)). Інсулін у плазмі крові вимірювали за допомогою радіоімунологічного аналізу з коефіцієнтом варіації (КВ) у межах 2,2%. Адипокіни та цитокіни плазми вимірювали методом ІФА (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США).

Метаболоміка сечі

Аналіз органічних кислот шляхом аналізу похідних триметилсилилу екстрагованих етилацетатом органічних кислот проводили з використанням ГХ-електронної МС, як описано раніше. 17 Дані накопичували шляхом повного збору сканованих іонів у діапазоні 50–600 м/з. Пікові дані були підтверджені пошуком бібліотек Національного інституту стандартів і технологій (NIST).

Аналіз SCFA у фекаліях

Спектри ядерно-магнітного резонансу (ЯМР) фекальної води були отримані за допомогою перенасичення ядерною спектроскопією Overhauser (NOESY) на чотириканальному спектрометрі Bruker Ascend 700 МГц (Брукер, Німеччина) та застосовано підхід `` цільового профілювання '' 18 для кількісної характеристики ЯМР-спектрів де концентрації визначали кількісно, ​​використовуючи 700 МГц бібліотеку від Chenomx NMR Suite V.7.1 (Chenomx, Едмонтон, Канада).

Воднево-метанові дихальні випробування

Виробництво водню та метану визначали кількісно, ​​використовуючи методи, подібні до раніше описаних методів.19 Коротко, після швидкого та визначеного базового значення протягом ночі зразки отримували з інтервалом у 15 хвилин протягом 3 год після прийому 10 г лактулози з газовим аналізом газовим хроматографом Breathtracker (Квінтрон, Мілуокі, Вісконсин).

Біоінформаційний та статистичний аналіз

Вживання мікроелементів стандартизували за допомогою лінійної регресії, скоригованої для загального споживання калорій із залишковими значеннями, відцентрованими та масштабованими. Аналіз основних компонентів, багатовимірне масштабування (MDS) та пермутаційний багатофакторний дисперсійний аналіз (PERMANOVA) були проведені в R. Зважені та незважені відстані UniFrac використовувались для порівняння загального складу мікробіомів між веганами та всеїдними тваринами та використовувались для аналізу MDS. Стандартизовані кількості мікроелементів та log-трансформовані метаболіти між веганами та всеїдовими порівнювали за допомогою t-тесту. Кластерний аналіз використовував відстані Манхеттена для зразків мікробіоти та коефіцієнти кореляції мікроелементів або метаболітів. Сума рангу Уілкоксона та точний тест Фішера виявили різницю чисельності бактеріальних родів між веганами та всеїдними. Класифікація випадкових лісів (RF) була використана для оцінки точності прогнозування даних метаболітів, щоб відрізнити веганів від всеїдних. Різноманітність бактерій визначали за індексом Сімпсона. PICRUSt використовувався для висновку про представлення генів за допомогою таксономічної інформації з секвенування генів 16S рРНК20

Результати

Вживання макроелементів та мікроелементів у всеїдних та веганів

Дієтичне споживання визначали кількісно, ​​використовуючи середнє значення за три години відкликання дієти. Дані для одного учасника були виключені через неймовірно низький рівень споживання калорій. Консолідація 155 макроелементів та мікроелементів у основні компоненти виявила чітке розділення дієтичного споживання між всеїдними та веганами (рисунок 1А). Вегани споживали більше вуглеводів, 296,9 (98,3) г проти 246,5 (81,2) г, але менше білка, 79,1 (22,9) г проти 89,1 (33) г та жиру, 63,8 (20,5) г проти 86,3 (39,1) г, ніж всеїдні тварини) 1B). Більше половини макроелементів та мікроелементів суттєво відрізнялися між групами (див. Додаткову таблицю S1), незважаючи на відносно невеликий розмір набору вибірки (n = 16 для всеїдних та n = 15 для веганів).

Порівняння дієтичного споживання між всеїдними та веганами, які проживають у міському середовищі США. (А) Принциповий компонентний аналіз споживання харчових мікроелементів у всеїдних та веганів. (Б) Теплова карта харчових мікроелементів у всеїдних (фіолетовий) проти веганських (зелений) кольорів, кодованих семи основними категоріями поживних речовин. Червоний = більша кількість, синій = менша кількість, значення p, вказані кількістю зірочок. ПК, основний компонент.

Лише незначні відмінності між мікробіотою кишок всеїдних та веганів.

Склад мікробіоти кишечника у всеїдних та веганів демонструє дуже скромні відмінності. Аналіз багатовимірного масштабування (MDS) складу мікробіоти кишечника у всеїдних та веганів, визначених секвенуванням генів 16S рРНК за допомогою (A) незваженої відстані UniFrac (PERMANOVA p = 0,007), (B) зваженої відстані UniFrac (PERMANOVA p = 0,15). (C) Порівняння індексу різноманітності Сімпсона у всеїдних та веганів (p = 0,53).

Метаболом плазми всеїдних тварин визначається в основному дієтою.

Користь для здоров'я рослинної дієти була добре описана.21 Наш протокол виключав учасників із синдромами імунодефіциту або значними захворюваннями шлунково-кишкового тракту, але в якості подальшої перевірки біомаркери, пов’язані з метаболічними захворюваннями, такими як індекс маси тіла (ІМТ), гомеостаз глюкози, маркери запалення та рівні ліпідів у плазмі крові порівнювали між всеїдними та веганами (див. додаткову фігуру S2 в Інтернеті). Лише загальний холестерин (р = 0,04) та ЛПНЩ (р = 0,016) відрізнялися між групами, причому рівні, як і очікувалось, були у всеїдних.

Порівняння метаболітів плазми у всеїдних та веганів. (А) Ієрархічна кластеризація корелюючих рівнів плазмових метаболітів між всеїдними тваринами та веганами, що візуалізується як теплова карта. Червоний = більша кількість, синій = менша кількість. (Б) Випадкова лісова класифікація 30 метаболітів плазми, розділена на сім областей (кольорово позначена), здатна відрізнити всеїдного від вегана з точністю прогнозу 94%. (C) Цільова кількісна оцінка метаболітів сечі у всеїдних та веганів, що візуалізується в аналізі основних компонентів, що відображає кореляцію кожного зразка з дескрипторами метаболітів. Дескриптори метаболіту представлені стрілками, що вказують у напрямку максимальної кореляції зі зразками.

Цілеспрямована кількісна оцінка сечових метаболітів, отриманих в результаті метаболізму мікробіотою кишечника, також виявляє значний поділ між всеїдними та веганами (рисунок 3С). Виявлення цих метаболітів як у сечі, так і в плазмі (див. Додаткову онлайн-таблицю S3) відображає динамічні взаємозв'язки, що регулюють рівні цих метаболітів у плазмі крові, які поглинаються господарем після продукування мікробіоти кишечника з подальшим виведенням із сечею.

На відміну від дієти, склад мікробіоти не був сильно пов'язаний з метаболомом плазми. У попарних асоціаціях мікробних таксонів та метаболітів після коригування для веганської та всеїдної дієти найсильнішою була асоціація Barnesiellaceae з цистином (p = 0,00002, q = 0,24); жодні унікальні бактеріальні таксони не були суттєво пов'язані з окремими рівнями метаболітів після коригування для багаторазового порівняння. У поєднанні зі скромним впливом цих дієт на склад мікробіоти кишечника (рис. 2), ця мінімальна асоціація узгоджується з домінуючою роллю дієти у визначенні метаболому господаря.

Залежні від дієти метаболіти, що виробляються мікробіотою кишечника веганів.

Вітаміни та інші продукти рослинного походження, такі як аскорбат, метаболіти ксантину та продукти метаболізму бензоатів, були підвищені в метаболомі плазми веганів щодо всеїдних. Деякі з них відображають рослинний раціон харчування веганів (малюнок 1B та див. Додаткову таблицю S1). Двадцять вісім метаболітів були більш поширеними у веганів зі значенням q, 28

Рівні плазмових метаболітів у всеїдних та веганів у плазмі крові, отримані в результаті метаболізму мікробіоти кишечника рослинних поліфенольних сполук. * p, 29 Ці відмінності пояснюються збільшенням мікробіоти, що руйнує полісахариди, в поєднанні зі збільшеним споживанням неперетравної клітковини, яка є субстратом для бактеріального бродіння.2 Однак, незважаючи на споживання рослинної дієти у веганів (рисунок 1B і див. додаткову таблицю S1 в Інтернеті, кількісне визначення рівнів SCFA у фекаліях за допомогою ЯМР протону (див. додаткову таблицю S4 в Інтернеті) та вироблення метану шляхом тестування на дихання (див. додаткову таблицю S5).

Проживання в аграрному суспільстві асоціюється з мікробіотою кишечника, що відрізняється від особин, що проживають у західних суспільствах. 2, 3, 30, 31 Геномне представлення для ферментативних шляхів, засноване на аналізі PICRUSt, свідчить про більший потенціал для виробництва SCFA у африканців у Буркіні Фасо (BF), ніж жителі Європейського Союзу (ЄС). Прогнозоване представлення генів для ферментів, що руйнують глікан, показало різницю між BF та суб'єктами ЄС (49 із 76 значущих; `` біосинтез та метаболізм глікану '' та `` перетравлення та всмоктування вуглеводів '' більші у BF, p = 1 × 10 −7 та 1 × 10 - 8 відповідно за тестом Welch з двох зразків t), тоді як подібний аналіз не показав різниці для всеїдних та веганів, що вивчались тут (p> 0,18 для обох порівнянь). Тим не менше, веганська дієта більше нагадувала жителів БФ, ніж ЄС - вегани демонструють більше споживання клітковини, вуглеводів та крохмалю з меншим споживанням енергії, жирів, білків та цукру (див. Додаткову таблицю в Інтернеті S4). Разом ці результати дозволяють припустити, що рівні SCFA у фекаліях, що визначаються бактеріальною ферментацією, регулюються як достатком субстрату, що забезпечується дієтою, так і бактеріальними лініями, що містять мікробіоту кишечника.32

Дієта та мікробіота кишечника у виробництві фітоестрогенів

Припускають, що фітоестрогени мають численні переваги для здоров’я.33 Еквол, фітоестроген, є побічним продуктом метаболізму ізофлавонів, що містяться у високих концентраціях у продуктах на основі сої. Хоча лише 30% дорослих у західних популяціях здатні виробляти еквол із ізофлавонів сої, майже 60% –70% жителів Азії є виробниками екволів.34 Всеїдні споживали відносно мало попередників фітоестрогену для утворення екволів (дайдзеїн та генінштейн) і жодного міг виявити еквол у плазмі. На відміну від цього, вегани споживали набагато більше попередників фітоестрогену для утворення екволу (рисунок 5), проте лише 40% веганів мали виявлений еквол у плазмі (р = 0,006). Серед веганів споживання ізофлавонів було дещо вищим серед споживачів із виявленим екволом у плазмі крові (рисунок 5), але жодна з цих тенденцій не була статистично значущою (daidzein p = 0,22; geninstein p = 0,21). Таким чином, ці дані також підкреслюють, що як вплив субстратів, так і мікробна метаболічна здатність спільно визначають кометаболіти, що спостерігаються в плазмі.

Асоціація між споживанням дієтичних субстратів, що використовуються мікробіотою кишечника для отримання екволу, що показує стандартизоване споживання діадзеїну та генейстеїну у всеїдних та веганів з і без виявлених рівнів екволу в плазмі крові.

Обговорення

Модель, що описує взаємозв'язок між кількістю субстрату та утворенням продукту мікробіоти кишечника, та його залежність від складу мікробіоти кишечника на прикладі споживання ферментованих вуглеводів та виробництва коротколанцюгових жирних кислот (СКЖК). Рослиноїдні ссавці та люди, що проживають в аграрних товариствах, з переважанням кишкових бактерій, здатних виробляти SCFA шляхом ферментації, мають `` дозвільну '' структуру спільноти своєї мікробіоти кишечника і демонструють лінійне вироблення продукту, залежного від субстрату. На відміну від цього, проживання людей у ​​вестернізованих суспільствах має «обмежувальну структуру спільноти», де додаткова доставка субстрату призводить до мінімального збільшення утворення продукту за рахунок насичення. Однак обидві структури спільноти залежать від субстрату, внаслідок чого зменшення споживання субстрату (тобто, всеїдні, що харчуються з низьким вмістом вуглеводів/клітковини) призведе до зменшення утворення продукту (SCFA).

Подяка

Ця робота була підтримана проектом NIH UH2/3 DK083981 та адміністративним додатком 04S1 (GDW, FDB та JDL), урядовою програмою Шотландії з питань харчування, землі та людей (HJF), Молекулярною біологією Ядра Пеннського центру молекулярних досліджень у травній та Хвороби печінки (P30 DK050306), Спільний центр з питань травлення, печінки та підшлункової залози Penn-CHOP та Веганське товариство Пенсільванії.