PLOS Genetics Фосфорилювання РНК Drosophila melanogaster РНК – Зв’язуючий білок ЯК за допомогою MAPKERK

ЯК має збережені консенсусні сайти з фосфо-акцепторами MAPK/ERK та докінгові домени.

plos

A. Схема ЯК (L) білкових доменів. Вказані місця розташування ТР-позицій в положеннях 59 і 64, глутамінової кислоти в положенні 106, необхідних для гомодимеризації, та чотири потенційні місця стикування MAPK/ERK. Домен STAR/GSG позначається кольоровими квадратами: домен QUA1 (світло-блакитний), домен maxi-KH (жовтий) та домен QUA2 (зелений). Також вказана зона, багата на тирозин на С-кінці (рожева). B. Вирівнювання HOW (L) амінокислотних послідовностей з 12 видів дрозофіл. Хоча T64 зберігається у всіх видів, T59 зберігається лише у п’яти з них (збережені залишки позначаються чорними рамками). E106 також повністю збережений, як і передбачувані місця стикування (не показано). C. Вирівнювання білка HOW (L) з білками ссавців QKI-5 та Sam68, а також гомологами нематод, GLD-1 та ASD-2. Домен Qua1 підкреслено світло-синім, домен maxi-KH жовтим, а Qua2 - зеленим. Зверніть увагу на збережені сайти TP, E106 та різні місця стикування, позначені рамками. І домен DEF, і другий D-домен (при aa 121) зберігаються в білках ссавців QKI і Sam68, тоді як перший (при aa 85) і третій (при aa 245) D-домени зберігаються в білках C. elegans (останнє також зберігається в QKI).

Малюнок 2.

ЯК (L) фосфорилюється in vitro та в клітинах S2R + за допомогою MAPK/ERK на одному або декількох сайтах TP.

Малюнок 3.

ЯК (L) фосфорилювання корелює з його гомодимеризацією.

Малюнок 4.

ЯК фосфорилювання посилює його спорідненість до РНК, не впливаючи при цьому на її субклітинну локалізацію.

А. Аналіз зв’язування РНК-білка in vitro. Конструкти, позначені HA як (L) WT, HOW (L) TTAA або HOW (L) EG, очищали від клітин S2R + шляхом імунопреципітації мітки HA з подальшим елюцією вільним пептидом HA. ЯК (L) WT-трансфіковані клітини або обробляли U0126, або не обробляли. Рівні обсяги очищених білків інкубували з міченими біотином 12-олігомерами, які або зв'язують HOW (верхня панель), або не зв'язують HOW (середня панель). Комплекси інкубували з авідиновими кульками, елюювали кип’ятінням у буфері зразків і реагували з анти-ХАВ у Вестерн-блот. Кількість білка HOW, що використовується для кожної реакції, була порівнянна (нижня панель). B – C ′. Локалізація HOW (L) не була змінена через мутації залишків Thr. Клітини, що експресують або ЯК (L) WT (B, B ′), або ЯК (L) TTAA (C, C ′), фарбували на ЯК (червоний, B – C). Злиття зображень (B′ – C ′) також містить GFP (зелений, позначає трансфіковані клітини) та Lamin (синій).

Малюнок 5.

Фосфорильований ЯК виявляється в ядрах соматичних м’язів та кардіобластів.

Малюнок 6.

ЯК регулює рівень РНК Sls та білка залежно від фосфорилювання.

Малюнок 7.

Дрозофіла MAPK прокатує напрям ЯК фосфорилювання в м’язах та регулювання рівня Саллімуса.

A. ЯК імунопреципітували з лізатів 3-х личинок першої інстанції, експресуючи згорнуту РНК у м’язах під mef2-GAL4 (ліворуч) або гетерозигот mef2-GAL4 дикого типу (w−, праворуч), і реагували з антитілом pTP для спостереження його фосфорилювання рівня та з анти-HOW для порівняння загальних HOW рівнів. Сирий екстракт реагували з анти-HOW та анти-тубуліном як контролем завантаження, показуючи, що загальна кількість HOW істотно не змінюється рівнями MAPK/прокатки. Зверніть увагу на зменшення ЯК фосфорилювання після експресії згорнутої РНКі. B. Зниження рівня MAPK/прокату підвищує рівень білка Sls. Ті ж генотипи, що і в А, були проаналізовані Вестерном з наступними антитілами (зверху вниз): анти-Sls, анти-MHC, анти-MSP300, анти-pERK (для перевірки зменшення активованого MAPK у цих личинок) та анти- α-актинін як контроль навантаження. C – H. Личинки дикого типу (C – E) та mef2-GAL4> прокат RNAi (F – H) фарбували анти-Sls антитілом (червоний, C, F) та анти-MSP-300 (синій, D, G). Злиття показано в E, H. Зверніть увагу на значне підвищення рівня Sls після зниження рівня MAPK/прокату.

  • Публікації
  • PLOS Біологія
  • PLOS медицина
  • PLOS Обчислювальна біологія
  • PLOS Генетика
  • Збудники хвороби PLOS
  • PLOS ONE
  • PLOS ігноровані тропічні хвороби

PLOS - некомерційна корпорація 501 (c) (3), № C2354500, що базується в Сан-Франциско, Каліфорнія, США