Плазмодесмати без калози та кальретикуліну у вищих рослин - відкриті канали для швидкого симпластичного транспорту?

Кирило Миколайович Демченко

1 Ботанічний інститут імені Комарова Російської академії наук, Санкт-Петербург, Росія

Войцеховська Ольга Василівна

1 Ботанічний інститут імені Комарова Російської академії наук, Санкт-Петербург, Росія

Катаріна Павловський

2 Кафедра екології, довкілля та рослинництва Стокгольмського університету, Стокгольм, Швеція

Анотація

ПЛАЗМОДЕСМАТИ ВИЩИХ РОСЛИН МІСТЯТЬ ДЕМОТУБУЛІ І ЗВИЧАЙНО АСОЦІЮЮТЬСЯ З КАРЛЕТИКУЛІНОМ

Припускають, що PD кілька разів незалежно еволюціонував у багатоклітинних водоростях, у тому числі у Characeae, предків вищих рослин (Raven, 2005). Цікаво, що не всі багатоклітинні водорості мають PD (Raven, 2005). Структура водоростей ПД відрізняється від структури вищих рослин, найбільш суттєво через відсутність десмотубул у ПВ водоростей (Cook et al., 1997; Cook and Graham, 1999). Однак є повідомлення про дезмотубули в PD Chlorophyceae і Characeae (Uronema, Stigeoclonium, Chara; Marchant, 1976; Brecknock et al., 2011).

Калретикулін (ЕЛТ), висококонсервативний Ca 2+ -зв'язуючий білок, виявлений у всіх багатоклітинних еукаріотах, що досліджувались до цього часу, переважно знаходиться в ER (Michalak et al., 1999). ЕЛТ була також виявлена у Гольджі (Borisjuk et al., 1998), а також у тварин також у цитоплазмі певних клітин (Dedhar, 1994) та на поверхні клітин (Johnson et al., 2001). Було показано, що ЕПТ локалізується на PD у верхівках коренів кукурудзи (Baluška et al., 1999), а також на PD у суспензійних культурах клітин тютюну та арабідопсису (Laporte et al., 2003; Bayer et al., 2004), припускаючи роль у клітинному транспорті. Ця пропозиція була підтверджена висновком про те, що ЕПТ взаємодіє з білком вірусного руху (Chen et al., 2005). Однак кореневі шапки PD не накопичують ЕПТ (Baluška et al., 1999, 2000). Постмітотичні клітини кореневого епідермісу, які, як і клітини кореневої шапки, є символічно ізольованими, також не накопичують ЕПТ (Baluška et al., 1999, 2000, 2001), що призводить до припущення, що ЕПТ може представляти маркер міцності раковини. Однак ЕПТ також утворюється у відповідь на різні стреси, і детальні спостереження призвели до гіпотези, що вона являє собою універсальний медіатор швидкого плазмодесматичного закриття (Bilska and Sowiński, 2010). Не зовсім зрозуміло, локалізована ЕПТ в ER - тобто поблизу початку десмотубули - або в клітинній стінці (Baluška et al., 1999; Bayer et al., 2004); проте порівняння імунолокалізації ЕПТ і калози сприяє локалізації в ЕР (Bayer et al., 2004).

CALLOSE ВІДГУЧАЄ РОЛЬ У РЕГУЛЮВАННІ ПРОДАЖУ PD

Транспорт через PD може регулюватися відкладенням калози, β-1,3-глюкану, між плазматичною мембраною та стінкою в області шиї, де звужується цитоплазматична кільця (Bucher et al., 2001; Simpson et al. ., 2009). Виробництво калози каталізується синтазами калози в клітинній стінці і викликається як біотичними, так і абіотичними стресами (Scheible and Pauly, 2004; Benitez-Alfonso and Jackson, 2009). Ідентифікація мутантів, що постраждали в клітинному окисно-відновному гомеостазі, а також у міжклітинному транспорті, і спостереження за змінами симпластичної проникності тканин у відповідь на обробку окисниками були інтерпретовані, щоб припустити, що міжклітинний транспорт регулюється у відповідь на продукцію реактивного види кисню (АФК) через утворення калози (Benitez-Alfonso and Jackson, 2009; Benitez-Alfonso et al., 2011).

ІНФІКОВАНІ КЛІТИНИ В КОРІННЯВИХ УЗЛАХ C. glauca ЗМЕНШЮЮТЬ СВОЇ ЗВ'ЯЗКИ З ПРИМІСЛЕНИМИ КЛІТИНАМИ В ХОДІ РОЗВИТКУ, ЩО ВІДПОВІДАНО ВТРАТІ АСОЦІАЦІЇ

Кореневі бульбочки, що фіксують азот, зокрема їх інфіковані клітини, що містять азотфіксуючі бактеріальні мікросимбіонти, які покладаються на рослину для забезпечення вуглецю, являють собою поглиначі вуглецю та джерела азоту. Аналіз механізмів розподілу флоему фотосинфату в актиноризальних вузликах австралійського дерева C. glauca показав, що тут плазмодезмальний зв’язок між інфікованими клітинами і в меншій мірі між інфікованими та неінфікованими клітинами зменшується під час диференціації інфікованих клітин (Schubert et al., 2013). Це стосувалося кількості, а також діаметра ПД. Кількість PD, що з’єднує інфіковані клітини кори, зменшилась сильніше, ніж кількість сполучених інфікованих із сусідніми неінфікованими клітинами кори (на 84 проти 60% відповідно), але зменшення діаметра було подібним в обох випадках (на 55 проти 49%, відповідно). Крім того, PD, що з’єднує зрілі інфіковані клітини кори, не накопичував ЕПТ (Schubert et al., 2013; Рисунки 1А, В ). Позначення ЕПТ спостерігалося лише в рідкісних випадках для PD, що з’єднує інфіковані та сусідні неінфіковані клітини, але було загальним для PD, що з’єднує неінфіковані клітини (Schubert et al., 2013; Рисунки 1C, D ).

Імунолокалізація кальретикуліну (ЕПТ) у поздовжніх зрізах вузликів C. glauca, вбудованих у віск Стідмана (для методу див. Zdyb et al., 2011; щодо антитіл, див. Baluška et al., 1999). Флуоресцентні мікрофотографії (A, C) та диференціальні інтерференційні мікрофотографії (B, D) показані. Зребені стінки заражених клітин флуоресцирують жовтим під синім світлом. (A, B) Позначення ЕПТ у стінках (див. Стрілку) між зараженими клітинами не виявлено (ic). (C, D) ЕПТ маркується на стінках, що з'єднують неінфіковані клітини (uic) у вигляді точкових точок. Смужки розміру позначають 20 мкм.

За умови припущення, що ЕПТ локалізована в ЕР при відкритті ПД, її відсутність може означати відсутність десмотубул. Мембрани десмотубул є найближчими сусідніми ліпідними бішарами, відомими в природі, діаметром 10–15 нм у найбільш стиснутому (Burch-Smith та Zambryski, 2012). Таким чином, при ПД діаметром відповідно 22 або 26 нм відсутність десмотубул не повинна дивувати, особливо з огляду на той факт, що білкові спиці повинні виступати з десмотубули, а глобулярні частинки з плазматичної мембрани в цитоплазматичній гільзі (Burch-Smith та Zambryski, 2012). Втрата десмотубул спостерігалася також у паразитованих нематодами клітинах корі коріння конюшини (Trifolium incarnatum) та помідорів (Solanum esculentum), але тут це явище було пов’язане зі збільшенням діаметру PD (Hussey et al., 1992).

PD ЗРІЛИХ ІНФІКОВАНИХ КЛІТИН КЛІТИНИ C. glauca НЕ ПОКАЗУЮТЬ КАЛОЗНОГО АКУМУЛЯЦІЇ

ЗРІЛІ ІНФІКОВАНІ КЛІТИНИ C. glauca АПОПЛАСТИЧНО ІЗОЛИРОВАНІ

Цікаво, що клітини, заражені C. glauca, повинні залежати від симплематичного надходження фотосинфатів, оскільки апопластичні транспортні шляхи заблоковані просоченням стінок заражених клітин дуже гідрофобним типом лігніну (Berg and McDowell, 1988; Schubert et al., 2013) . Вважається, що властивості клітинної стінки, що оточує PD, можуть обмежувати ступінь розширення мікроканалів (Kragler et al., 1998). Отже, це лігніфікація, яка починається після зараження мікросимбіонтом, є найбільш вірогідним поясненням спостережуваного зменшення діаметра PD у клітинах, інфікованих C. glauca. Хоча відомо багато випадків, коли лігніфікація або суберизація клітинних стінок не впливає на PD, що перетинає ці клітинні стінки, у таких випадках PD організовуються в полях первинних ям, тобто в зонах зі зменшеною товщиною первинної стінки і без відкладення вторинної клітинної стінки. (Robinson-Beers and Evert, 1991) і, мабуть, із характерним складом клітинної стінки (Orfila and Knox, 2000), тоді як в інфікованих клітинах вузликів C. glauca первинні стінки лігніфікуються, тобто PD перетинає зріджені частини стіни.

ЯКІ ЕФЕКТИ ЗМІНИ В ПІД ІНФІКОВАНИХ КЛІТИН УЗЛОВОК C. glauca НА СИМПЛАСТИЧНИЙ ТРАНСПОРТ?

Діаметри PD, що з’єднують інфіковані клітини з сусідніми інфікованими або неінфікованими клітинами, значно зменшені порівняно з діаметрами, що з'єднують неінфіковані клітини (Schubert et al., 2013). Відсутність каллози та калозосинтази означало б відсутність негативної регуляції SEL цих PD шляхом відкладення калози. Подібним чином не спостерігалося відкладення калози вздовж клітинних стінок між гігантськими клітинами в місцях годування тютюну нематодами, але часто відкладення калози було виявлено вздовж клітинних стінок у напрямку до сусідніх клітин (Hofmann et al., 2010).

Повна відсутність мічення ЕЛТ на PD, що з’єднує інфіковані клітини, і рідкість мітки ЕЛТ на PD, що з’єднує інфіковані та сусідні неінфіковані клітини, не можуть бути пов’язані з гіпотезою, що ЕПТ являє собою маркер міцності стоку (Baluška et al., 2001), оскільки ці клітини, що експресують сахарозу-синтазу на високому рівні, є сильними поглиначами (Schubert et al., 2013). Крім того, інфіковані клітини є мікроаеробними (Berg and McDowell, 1987; Schubert et al., 2013), і, як правило, виснаження АТФ призводить до відкриття PD (Cleland et al., 1994). Однак втрата маркування ЕЛТ відповідає гіпотезі про те, що ЕПТ є посередником швидкого плазмодесмального закриття. По-перше, механізм закриття PD, що включає ЕПТ, може не мати можливості функціонувати в PD, що перетинає злежені первинні клітинні стінки. По-друге, оскільки заражені клітини апопластично ізольовані, додаткова симпластична ізоляція означала б загибель клітини, а тому не повинна бути надто простою для встановлення.

ПД ІНФІКОВАНИХ КЛІТИН КЛІТИКИ C. glauca - НА ШЛЯХУ ПОВНОВОГО ЗАКРИТТЯ АБО ВІДКРИТИХ КАНАЛІВ ДЛЯ ОПТИМІЗОВАНОГО СИМПЛАСТИЧНОГО ТРАНСПОРТУ?

Для того, щоб перевірити, яка з цих гіпотез правильна, може бути використана конструкція, що експресує зелений флуоресцентний білок (GFP) під контролем промотора, специфічного для неінфікованих вузликових клітин кори. На сьогоднішній день не охарактеризовано жодної експресії, що рухає промотор, специфічну для неінфікованих корінкових клітин кори головних клітин C. glauca; однак, Perrine-Walker та ін. (2011) описали носій викиду ауксину (CgPIN1), який був присутній конкретно в неінфікованих, а не в інфікованих вузликових клітинах кори. Отже, промотор CgPIN1 може бути використаний для стимулювання експресії GFP у неінфікованих вузликових клітинах кори. З молекулярною масою 27 кДа і радіусом Стокса 1,8 нм, GFP може подорожувати через PD, що з’єднує корінні клітини кори (Stadler et al., 2005), а також повинен мати можливість проходити через PD, що з’єднує інфіковані сусідніми неінфікованими клітинами кори. C. glauca. Конструкція злиття β-глюкуронідази (GUS) з тим же промотором може служити негативним контролем, оскільки з молекулярною масою 68 кДа та радіусом Стокса 3,3 нм (Fisher and Cash-Clark, 2000), GUS не може подорожувати через більшість PD (Фукуда та ін., 2005). Якщо цитологічний аналіз покаже наявність GFP в інфікованих клітинах трансгенних вузликів, більші конструкції GFP можуть бути протестовані для точної оцінки SEL PD інфікованих клітин.

Заява про конфлікт інтересів

Автори заявляють, що дослідження проводилось за відсутності будь-яких комерційних або фінансових відносин, які можна трактувати як потенційний конфлікт інтересів.

Подяка

Ця робота була підтримана грантом Шведської дослідницької ради ВР для Катаріни Павловський та грантами Російського фонду фундаментальних досліджень (11-04-02022-a, 12-04-32002, 13-04-40344, 13-04- 02000), а також Фокусна програма Президії Російської академії наук Кирилу Н. Демченко та Ользі Володимирівні Войцеховській.