Роман Ліпопептайбол Емеріцеліпсин А з протимікробною та протипухлинною активністю, що виробляється екстремофільним лугом Emericellopsis

Рогожин Євген Олександрович

1 Інститут біоорганічної хімії ім. Шемякіна та Овчинникова РАН, вул. Міклухо-Маклая, 16/10, Москва 117997, Росія; ude.hcetsyhp@aphsul (В.А.Л.); [email protected] (K.S.M.)

2 Інститут нових антибіотиків імені Гауза, вул. Велика Пироговська, 11, Москва 119021, Росія; ur.liam@90_avokydas (V.S.S.); ur.tsil@awonarabajna (A.A.B.); ur.xednay@aniram-i (М.Л.Г.)

Віра Сергіївна Садикова

Баранова Анна Олександрівна

Васильченко Олексій Сергійович

3 Тюменський державний університет, вул. Володарського, 6, Тюмень 625003, Росія; moc.liamg@oknehclisava (A.S.V.); [email protected] (A.V.V.)

Владислав Олександрович Лушпа

4 Московський фізико-технічний інститут, Інститутський пер., 9, Долгопрудний 141701, Росія

Костянтин Сергійович Мінєєв

4 Московський фізико-технічний інститут, Інститутський пер., 9, Долгопрудний 141701, Росія

Марина Л. Георгієва

5 Московський державний університет імені Ломоносова, 1-12 Ленінські гори, Москва 119991, Росія

Олександр Б. Кулько

6 Московський урядовий відділ охорони здоров'я Науково-клінічний протитуберкульозний центр, вул. Строминка, 10, Москва 107014, Росія; ur.xednay@ignuf-okluk

Михайло Євгенович Крашенінніков

7 Інститут молекулярної медицини, Відділ передових клітинних технологій, Інститут регенеративної медицини, Перший Московський державний медичний університет імені Сеченова, вул. Трубецька, 8, корп. 2, Москва 119991, Росія; ur.relbmar@nehsark (M.E.K.); moc.liamg@pudnuyl (А.В.Л.)

Люндюп Олексій Васильович

Анастасія Васильченко

3 Тюменський державний університет, вул. Володарського, 6, Тюмень 625003, Росія; moc.liamg@oknehclisava (A.S.V.); [email protected] (A.V.V.)

Андрєєв Ярослав Олександрович

Пов’язані дані

Анотація

1. Вступ

2. Результати та обговорення

Емерікеліпсин А був виділений з рідини культури грибів, як описано раніше із зміною [7]. Схема включає комбінацію екстракції етилацетату з подальшим випаровуванням, розчиненням у етанолі та аналітичною ВЕРХ з оберненою фазою на фазі С18 [7]. Для отримання окремого компонента використовували одну додаткову стадію очищення, засновану на аналітичній фенільній RP-HPLC. Як результат, у описаній раніше активній фракції було виявлено два різні компоненти (рис. 1). Антимікробний аналіз цих сполук виявив активність для другого піку, який позначається як емерицеліпсин А. Мас-спектрометрія дозволила ідентифікувати моноізотопну молекулярну масу 1049,76 Да. Структуру цього пептиду визначали за допомогою ЯМР-спектроскопії.

Очищення емерицеліпсину А за допомогою феніл-модифікованої обернено-фазової ВЕРХ. Цільовий пік був позначений чорною зіркою. Конкретні описи: MeCN — ацетонітрил; 2-Р — ізопропанол.

Структура емерицеліпсину А визначається за допомогою ЯМР-спектроскопії. Нумерація залишків амінокислот і жирних кислот показана відповідно до таблиці S1.

Таблиця 1

Антибактеріальна активність емерицеліпсину А щодо бактерій.

Мікроорганізми Штами MIC, мкг/млІндоліцидин Емерицеліпсин AVанкоміцинНорфлоксацин

Грамнегативний	Кишкова паличка MG1655	25	> 300	> 200	0,08
	Salmonella enterica ATCC 14028	100	> 300	> 200	1,25
	Синьогнійна паличка ATCC 27853	100	> 300	> 200	2.5
Грампозитивний	Bacillus cereus ATCC 14893	12.5	16	12.5	> 28
	Золотистий стафілокок FDA 209 P	12.5	4	3.1	0,31
	Listeria monocytogenes EGDe	3.25	32,5	0,38	1,75

Таблиця 2

Поглинання 1-N-фенилнафтиламіну (NPN) Escherichia coli MG 1655, індуковане пермеабілізаторами.

Коефіцієнт поглинання NPN ± SD

Кишкова паличка MG1655	1,5 ± 0,05
Escherichia coli MG1655, оброблений 0,5 М EDTA	1,83 ± 0,1
Кишкова паличка MG1655, оброблена 7 мкг/мл емерицеліпсину А	2,0 ± 0,1
Кишкова паличка MG1655, оброблена 15 мкг/мл емерицеліпсину А	2,3 ± 0,2
Кишкова паличка MG1655, оброблена 30 мкг/мл емерицеліпсину А	4,7 ± 0,2

Цікаво, що таку ж залежність в антимікробній активності продемонстрував контрольно-позитивний контроль - ванкоміцин, який належить до групи глікопептидних антибіотиків [14] і структурно не схожий на емерицелліпсин А. Той самий ефект був продемонстрований для пептайболу емерицицину IV, який був виділений з мінімальної кількості Emericellopsis і виявляє бактерицидну активність щодо метицилінорезистентної S. aureus та стійкої до ванкоміцину Enterococcus faecalis (грампозитивні види); Грамнегативна кишкова паличка була стійкою [15]. Загалом, основний механізм дії пептаіболу пов'язаний з порушенням клітинних мембран [1,16].

Більші пептаіболи з більш ніж 15 амінокислотами можуть утворювати стійкі спіралеподібні структури в мембрані [17]. Ці спіралі можуть асоціюватися в олігомерах і утворювати іонні канали в мембрані. Коротші пептайболи менш мембранно активні, і тому спосіб їх дії є більш складним. Їх дія може полягати у поєднанні руйнуючої мембрану активності та впливу на різні молекулярні мішені [9,18]. Тим не менш, короткі пептаіболи можуть впливати на мембрану за допомогою різноманітних механізмів: вони можуть утворювати кінцеві пучки всередині двошару, тим самим ефективно подвоюючи їх довжину перпендикулярно бішару, або вони можуть утворювати пов'язані з мембраною агрегати або діяти за допомогою миючого засобу -подібний механізм. Отже, властивості пептаіболів дозволяють їм виявляти різну активність при націлюванні на різні типи мембранних ліпідів. Відповідно, вони впливають на організми з іншими мембранними характеристиками, ніж їх власні [19,20].

Ми оцінили здатність емерицеліпсину А порушувати бактеріальні бар'єрні структури. Використовуючи ДНК-зв’язуючі плями SYTO9 та йодид пропідію (PI), ми досліджували динаміку їх внутрішньоклітинного накопичення в режимі реального часу. Ця фарбована суміш активно використовується для дослідження способу дії AMP. Часто такий підхід дозволяє отримати унікальну інформацію про особливості дії пептидів, яка недоступна для інших методів, наприклад, бактеріологічних [21,22]. Зелений флуоресцентний SYTO 9 є відносно невеликою молекулою (

400 Da), який здатний проникати через непошкоджені бактеріальні мембрани, тоді як PI - це велика молекула (668 Da), яка проникає лише в пошкоджені клітинні бар'єрні структури [23]. Емісійні властивості фарбувальної суміші, зв’язаної з ДНК, змінюються внаслідок витіснення однієї плями іншою та гасіння флуоресцентним резонансним переносом енергії [24].

Раніше ми успішно застосовували цей підхід для дослідження способу дії різних антимікробних пептидів [25]. Ми показали, що цей ефект справді має місце, коли ПІ зміг влитися в клітини через невпорядкований бар'єр після витіснення SYTO9 з ДНК [26].

Додавання пептайболу до клітин S. aureus призвело до негайного гасіння флуоресценції SYTO9 (рис.3).

Динаміка проникнення SYTO 9 в S. aureus 209 P (a) та кишкової палички MG 1655 (b) клітини, оброблені емерицеліпсином А. Позначення: 1—75 мкг/мл; 2—32,3 мкг/мл; 3—16 мкг/мл; 4 — негативний контроль; 5 - позитивний контроль. Якщо бактеріальні мембрани проникають, ПІ проникає всередину клітини. Далі йде витіснення SYTO 9 з ДНК, що призводить до зменшення інтенсивності люмінесценції в зеленій області спектра. Чиста вода та 20% алкоголю служили негативним та позитивним контролем відповідно. Стрілки показують час випробування речовини.

Ця подія свідчить про порушення цитоплазматичної мембрани S. aureus під час лікування. У свою чергу змішування емерицеліпсину А з клітинами E. coli не змінило кінетики флуоресценції SYTO9, що свідчить про те, що лише клітини з низькою молекулярною масою здатні переноситися в клітину. Однак емерицеліпсин А може впливати на клітинні стінки грамнегативних бактерій. Порушення зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій було виявлено за допомогою гідрофобного флуоресцентного зонда. 1-N-фенилнафтиламін (NPN) - це гідрофобна, нейтрально заряджена речовина, яка зазвичай непроникна у зовнішню мембрану, але якщо молекули NPN інтерналізуються у фосфоліпідних середовищах, його флуоресценція сильно зростає [27,28].

Додавання різних концентрацій емерицеліпсину А до E. coli MG 1655 призвело до збільшення інтенсивності флуоресценції NPN залежно від дози (табл. 2). Максимальна відповідь спостерігалася при концентрації 30 мкг/мл.

Отже, спосіб дії емерицелліпсину А пов’язаний з порушенням бактеріальної цитоплазматичної мембрани, що відбулося протягом декількох хвилин і призвело до загибелі грампозитивних бактерій. У той же час зовнішня мембрана грамнегативних бактерій також зазнає удару, захищаючи цитоплазматичну мембрану від молекул пептаіболу. Вивчений пептид забезпечує виживання E. coli, але може вплинути на їх вірулентність, наприклад, при утворенні біоплівки.

Емеріцелліпсин А виявляв протигрибкову активність широкого спектру в аналізі дифузії агару; він пригнічував ріст усіх видів Candida та ниткоподібних грибів A. niger ATCC 16404 та A. fumigatus KBP F24 у концентрації 40 мкг/на диск. Були продемонстровані різні рівні сприйнятливості для клінічних мультирезистентних ізолятів Aspergillus, які вказували на специфічну для штаму чутливість до пептаіболу. Точніше, пептаібол був ефективним проти A. niger 219, A. fumigatus 163, A. flavus 905 і був незначно ефективним проти A. tereus 1133. Як показано в таблиці 3, помірний інгібуючий ефект пептайболу спостерігався щодо всіх ізолятів роду Aspergillus (значення MIC 4 мкМ), а також спостерігалася сильна протигрибкова активність щодо лікарсько-стійких ізолятів C. tropicales 1402 та C. albicans 1582 з однаковим значенням MIC 2 мкМ. Примітно, що клінічні дріжджові ізоляти були більш сприйнятливі до пептаіболу, ніж ізоляти Aspergillus. Ця знахідка добре узгоджується з існуючими даними про спектр активності грибкових пептаіболів [29,30,31]. Примітно, що клінічні дріжджові ізоляти були більш сприйнятливі до пептайболу, ніж ізоляти Aspergillus.

Таблиця 3

Мінімальні інгібуючі концентрації (MIC) емерицеліпсину А проти грибів, мкг/мл.