Металотіоїн запобігає порушенню серцевої скорочувальної функції, спричиненої дієтами з високим вмістом жиру

Роль проліфератора пероксисоми - активований рецептор γ-коактиватор 1α та мітохондріальний біогенез

  1. Фен Донг,
  2. Кунь Лі,
  3. Наїр Среджаян,
  4. Дженніфер М. Нанн і
  5. Червень Рен
  1. Від Центру серцево-судинних досліджень та нетрадиційної медицини Університету Вайомінг, Ларамі, Вайомінг
  1. Зверніться до кореспонденції та запитів на передрук до д-ра Джун Рен, Центр серцево-судинних досліджень та нетрадиційної медицини, Університет Вайомінгу, Ларамі, штат Вісконсин 82071. Електронна пошта: jrenuwyo.edu

Роль проліфератора пероксисоми - активований рецептор γ-коактиватор 1α та мітохондріальний біогенез

Анотація

  • EDD, кінцевий діастолічний діаметр
  • ESD, кінцевий систолічний діаметр
  • FFI, інтенсивність флуоресценції фура-2
  • мтДНК, мітохондріальна ДНК
  • mtTFA, фактор транскрипції мітохондрій A
  • NRF, ядерний дихальний фактор
  • PGC-1α, проліфератор пероксисоми, активований рецептором γ-коактиватор-1α
  • АФК, активні форми кисню
  • Sirt, безшумний регулятор інформації
  • TPS, час до пікового вкорочення
  • TR90, час до 90% відновлення

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Дієтичне годування з високим вмістом жиру та внутрішньочеревний тест на толерантність до глюкози.

Описана тут експериментальна процедура була схвалена нашим інституційним комітетом з питань догляду за тваринами. Коротше кажучи, чотиримісячні чоловічі FVB та серцево-специфічні надмірні експресії металотіоїну трансгенні миші вагою ∼20 г були випадковим чином розподілені на дієти з низьким вмістом жиру (10% загальної калорійності) або з високим вмістом жиру (45% загальної калорійності) (Дослідження Дієти, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі) протягом 5 місяців. Дієта з високим вмістом жирів була калорійно насиченою (4,83 проти 3,91 ккал/г при дієті з низьким вмістом жиру) завдяки вищому складу жиру. Однак обидві дієти мали подібний поживний склад. Мишей поселяли індивідуально в кліматично контрольованому середовищі з 12-годинним циклом світло/темрява та вільним доступом до дієти та води. Колір хутра був використаний як маркер для ідентифікації металотіонеїну (темно-коричневий) або FVB (білий). Після 5 місяців годування всім мишам голодували протягом 12 год, а потім вводили внутрішньочеревно ін’єкцію глюкози (2 г/кг маси тіла). Зразки крові відбирали з хвоста безпосередньо перед викликом глюкози, а також через 15, 60 та 120 хв. Рівні глюкози в сироватці крові визначали за допомогою аналізатора глюкози Accu-Chek III (15). Систолічний та діастолічний артеріальний тиск досліджували за допомогою напівавтоматизованого посиленого приладу для хвоста. Рівні інсуліну в крові вимірювали за допомогою набору для імуноферментного аналізу інсуліну миші.

діабет

Ехокардіографічна оцінка.

Геометрію та функції серця оцінювали у знеболених (Avertin 2,5%, 10 мкл/г тіла з масою в/в) мишей за допомогою двовимірної керованої М-ехокардіографії (Sonos 5500), оснащеної лінійним перетворювачем 15–6 МГц. Товщину передньої та задньої стінок та діастолічний та систолічний розміри лівого шлуночка реєстрували на знімках у М-режимі, використовуючи метод, прийнятий Американським товариством ехокардіографії. Фракційне вкорочення обчислювали за кінцевим діастолічним діаметром (EDD) та кінцевим систолічним діаметром (ESD), використовуючи таке рівняння: (EDD - ESD)/EDD. Частота серцевих скорочень усереднювалася за 10 серцевих циклів (16).

Виділення кардіоміоцитів.

Після седації кетаміну/ксилазину серця видаляли і перфузували бікарбонатним бікарбонатом (KHB) Кребса-Генселейта (KHB), що містив (у ммоль/л): 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES та 11,1 глюкози. Серця перетравлювали колагеназою D протягом 20 хв. Ліві шлуночки були видалені та подрібнені перед фільтруванням. Вихід міоцитів становив ~ 75%, і на нього не впливала дієта з високим вмістом жиру та металотіоїн. Для механічного та внутрішньоклітинного дослідження Ca 2+ були відібрані лише паличкоподібні міоцити з чіткими краями (15).

Вкорочення/подовження клітин.

Механічні властивості кардіоміоцитів оцінювали за допомогою системи м'яких країв IonOptix (IonOptix, Milton, MA). Міоцити поміщали в камеру, встановлену на сцені мікроскопа Olympus IX-70, і суперконфузували (~ 2 мл/хв при 25 ° C) з гідрокарбонатним буфером Кребса-Генселейта, що містить 1 ммоль/л CaCl2. Міоцити стимуляції поля проводили при 0,5 Гц, якщо не зазначено інше. Оцінювали вкорочення та подовження клітин, включаючи пікове вкорочення, що вказує на пікову скоротливість; час до PS (TPS) із зазначенням тривалості скорочення; відновлення часу до 90% (TR90), що вказує на тривалість релаксації; і максимальні швидкості укорочення/відновлення (± dL/dt), що вказує на максимальний розвиток і зниження тиску (15).

Внутрішньоклітинні перехідні процеси Ca 2+.

Когорту міоцитів завантажували фура-2/АМ (0,5 мкмоль/л) протягом 10 хв, і інтенсивність флуоресценції реєстрували за допомогою системи флуоресценції з подвійним збудженням (Ionoptix). Міоцити поміщали на інвертований мікроскоп Olympus IX-70 і знімали через масляну об'єктив Fluor × 40. Клітини піддавали дії світла, випромінюваного лампою потужністю 75 Вт, і пропускали через фільтр 360 або 380 нм, стимулюючи стискатися при 0,5 Гц. Випромінювання флуоресценції було виявлено між 480 і 520 нм, і якісна зміна інтенсивності флуоресценції фура-2 (FFI) визначалась із співвідношення FFI на двох довжинах хвиль (360/380). Час розпаду флуоресценції (одноразовий або двоекспоненційний розпад) розраховували як показник внутрішньоклітинного очищення Ca 2+ (15).

Аналіз виробництва АФК.

Виробництво клітинних АФК оцінювали шляхом аналізу змін інтенсивності флуоресценції, що виникають внаслідок окислення внутрішньоклітинного фторпробувача DCF [5- (6) -хлорметил-2 ', 7'-дихлордигідрофлуоресцеїндіацетат]. Коротше кажучи, кардіоміоцити завантажували 10 мкмоль/л DCF при 37 ° C протягом 30 хв. Міоцити промивали, а потім вимірювали інтенсивність флуоресценції, використовуючи флуоресцентний зчитувач мікропланшетів при довжині хвилі збудження 480 нм і довжині хвилі випромінювання 530 нм. Неліковані клітини не виявляли флуоресценції і використовувались для визначення фонової флуоресценції (17).

Трансмісійна електронна мікроскопія.

Ліві шлуночки фіксували 2,5% глутаральдегідом/1,2% акролеїну у фіксуючому буфері (0,1 моль/л какодилату, 0,1 моль/л сахарози, рН 7,4) та 1% тетроксиду осмію, потім 1% уранілацетату та зневоднювали через градуйовану серію концентрацій етанолу перед введенням у смолу LX112 (LADD Research Industries, Burlington, VT). На ультрамікротомі вирізали надтонкі зрізи (∼50 нм), пофарбували уранілацетатом з подальшим цитратом свинцю та переглянули на трансмісійному електронному мікроскопі Hitachi H-7000, оснащеному цифровим фотоапаратом із зарядженим пристроєм з охолодженням 4K × 4K (18 ). Кількісний аналіз розміру та щільності мітохондрій проводили зі збільшенням × 4000. Для кожного серця миші оцінювали в середньому від шести до семи полів зору.

Вестерн-блот-аналіз.

Білок готували, як описано (15). Підмножина кардіоміоцитів мишей FVB та металотіоїну спочатку інкубували при 37 ° C з вільною жирною кислотою пальмітиновою кислотою (1 ммоль/л) (див. Додаткові методи в Інтернеті [доступно за адресою: http://dx.doi.org/10.2337/db06- 1596] для приготування пальмітинової кислоти) за 24 год до визначення експресії PGC-1α. Зразки, що містять однакову кількість білків, розділяли на 10% SDS-поліакриламідних гелях в апараті мінігелю (Mini-PROTEAN II; Bio-Rad) і переносили на нітроцелюлозні мембрани. Мембрани блокували 5% молоком у буферному сольовому розчині, забуференному Трісом, і інкубували протягом ночі при 4 ° C з анти-Akt, анти-pAkt, анти-Foxo1a, анти-pFoxo1a (Thr24), антишумим регулятором інформації (Sirt ), анти-Foxo3a, анти-pFoxo3a (Thr32), PGC-1α (усі по 1: 1000) та анти-β-актин (1: 5000). Після імуноблотингу плівку сканували та інтенсивність смуг імуноблоту визначали каліброваним денситометром Bio-Rad.

Загальна екстракція РНК, синтез кДНК, зворотна транскрипція та ПЛР у реальному часі.

Визначення числа копії мтДНК.

Відносну кількість копії mtDNA серця визначали за допомогою RT-PCR, як описано (20). Загальну ДНК витягували за допомогою набору тканин Qiagen DNeasy; Використовували 10 нг ДНК, і цільовим геном був мітохондріальний нікотинамід адениндінуклеотиддегідрогеназа-5 (ND-5). Праймерами для ND-5 були: прямий 5′TGG ATG ATG GTA CGG ACG AA-3 ′, зворотний 5′-TGC GGT TAT AGA GGA TTG CTT GT-3 ′. Якісну RT-PCR проводили з використанням термоциклера BioRad у режимі реального часу в поєднанні з технологією SYBR Green та наступними параметрами циклічності: стадія 1, 50 ° C протягом 2 хв; стадія 2, 95 ° С протягом 10 хв; і стадія 3, 40 циклів при 95 ° С протягом 15 с і при 55 ° С протягом 45 с. Кожен зразок аналізували у двох примірниках. Відносне число копій мітохондрій до числа ядерних копій оцінювали методом порівняльного порогового циклу, використовуючи β-актин як внутрішній контроль.

Аналіз даних.

Дані представлені як середні значення ± SEM. Статистичне порівняння проводили за допомогою ANOVA, після чого проводили спеціальний тест Ньюмана-Кельса. Значимість була встановлена ​​для властивостей P 2+.

Ні дієта з високим вмістом жиру, ні металотіоїн не впливали на довжину міоцитів у стані спокою. Годування з високим вмістом жиру суттєво знижує пікове вкорочення та ± dL/dt, а також тривалий TR90, не впливаючи на TPS в кардіоміоцитах мишей FVB, дещо нагадуючи наші попередні знахідки (8). Важливо, що металотіонін скасував індуковані механічними відхиленнями від дієти з високим вмістом жиру (рис. 2). Крім того, кардіоміоцити мишей з високим вмістом жиру демонстрували значно підвищений вихідний рівень внутрішньоклітинного Са 2+, пригнічений внутрішньоклітинний підйом Са 2+ у відповідь на електричний стимул (ΔFFI) та зниження швидкості розпаду внутрішньоклітинного Са 2+ (одноразового або дво- експоненціальна крива підходить). Металлотіонін заперечував подовження, спричинене дієтами з високим вмістом жиру, при внутрішньоклітинному розпаді Ca 2+ та депресії при ΔFFI з незначним впливом на підвищену базову FFI. Сам металлотіонін не впливав на жодне з випробовуваних внутрішньоклітинних властивостей Ca 2+ (рис. 3).

Вплив дієти з високим вмістом жиру та металотіоїну на частоту стимулів до взаємозв’язку пікових скорочень.

Серце миші б'ється на високих частотах (> 400/хв при 37 ° C). Щоб дослідити можливе порушення серцевого зв’язку збудження-скорочення на більш високих частотах, частоту стимулювання збільшували поступово з 0,1 до 5 Гц (300 ударів/хв). Спочатку клітини стимулювали скорочуватися при 0,5 Гц протягом 5 хв, щоб забезпечити стійкий стан перед початком частотного протоколу. Всі записи нормалізували до пікового вкорочення, отриманого при 0,1 Гц тієї ж комірки. Міоцити з групи жирного жиру демонстрували значно перебільшену депресію при піковому укороченні при 3,0 та 5,0 Гц без змін на низьких частотах. Сам трансген металотіонеїну мав незначний ефект на всіх перевірених частотах. Однак він скасував індуковану дієтою депресію при піковому вкороченні при 3,0 та 5,0 Гц (рис. 3Е).

Вплив дієти з високим вмістом жиру та металотіоїну на електронно-мікроскопічні характеристики серця.

Без дієтичного лікування з високим вмістом жиру у зразках серця між групами FVB та металотіоїну не спостерігалося різниці ультраструктур (рис. 4A та B). Харчування з високим вмістом жиру спричинило значні вогнищеві пошкодження серця мишей FVB, що характеризуються набряком мітохондрій, дезорганізацією крист та втратою цілісності саркомеру (рис. 4C). Відповідно до механічних спостережень, металлотіонін заперечував пошкодження серцевої структури, спричинені дієтою, спричиненою жирами (рис. 4D). Тканини міокарда від мишей, що харчуються металотіоніном з високим вмістом жиру, ультраструктурно не відрізнялися від груп дієти з низьким вмістом жиру. Кількісний аналіз показав, що дієта з високим вмістом жиру значно зменшила щільність, але не розмір мітохондрій у серцях мишей FVB, ефект яких був зведений нанівець металотіоніном (рис. 4E та F).

Вираження в коефіцієнтах Akt, pAkt, PGC-1α, Sirt та PGC-1α та кількості копій mtDNA.

Вплив пальмітинової кислоти на експресію PGC-1α у FVB та кардіоміоцитах мишей металотіоїну.

Для вивчення причинно-наслідкового зв’язку із захистом від металотіоїну проти зниженого регулювання PGC-1α, спричиненого дієтою, ми провели дослідження in vitro для інкубації кардіоміоцитів з пальмітиновою кислотою (1 ммоль/л) протягом 24 годин. Наші імуноблоти показали, що пальмітинова кислота суттєво знижує регуляцію експресії PGC-1α у FVB, але не у мишей з металотіоїном (рис. 5F), припускаючи, що вільні жирні кислоти можуть безпосередньо знижувати регулятор коактиватора біогенезу мітохондрій та відігравати роль у впливі на дієту з високим вмістом жиру на PGC-1α.

Вираження факторів транскрипції Forkhead Foxo1a та Foxo3a.

Відомо, що PGC-1α взаємодіє з низкою сигнальних шляхів, включаючи фактори транскрипції Forkhead, які можуть коактивуватися PGC-1α при регуляції глюконеогенних та гемобіосинтетичних генів (21). Оцінка експресії факторів транскрипції Forkhead Foxo1a та Foxo3a показала, що дієтичне харчування з високим вмістом жиру значно посилювало фосфорилювання Foxo3a, не впливаючи на загальну експресію білка Foxo1a та Foxo3a, а також на фосфорилювання Foxo1a. Металотіонеїн не зміг змінити ні загальну, ні фосфорильовану форму обох факторів транскрипції Forkhead за режиму з низьким або високим вмістом жиру (рис. 7).

ОБГОВОРЕННЯ

У нашому цьому дослідженні дієта з високим вмістом жиру викликала фосфорилювання Foxo3a без змін у каскаді Akt, фосфорилювання Foxo1a та загальної експресії Foxo. Akt є важливим фактором серцевого виживання для підтримки скорочувальної функції серця (32). Тим не менше, наші дані не сприяли будь-якій головній ролі Akt та його подальшого сигналу Foxo у кардіопротекторії, пропонованому металотіонеїном, проти прийому дієти з високим вмістом жиру. Хоча наші спостереження за посиленим фосфорилюванням Foxo3a, схоже, збігаються з серцевою гіпертрофією при вживанні жиру через інгібування опосередкованого Форкедом апоптозу, той факт, що металотіоїн захищає гіпертрофію серця та дисфункцію міокарда від прийому жиру, не впливаючи на підвищений рівень pFoxo3a альтернативних або компенсаторних механізмів. Насправді нещодавно було показано, що регулятор мітохондрій PGC-1α пригнічує транскрипційний фактор Foxo3 та бере участь у лізосомному протеолізі та деградації білка (14). Однак наше дослідження не виявило взаємодії між PGC-1α та факторами транскрипції Forkhead.

Що стосується експериментальних обмежень, в ідеалі миші з різними фармакологічно або генетично зміненими рівнями металотіоїну повинні допомогти продемонструвати, чи існує якась міцна взаємозв'язок між дієтичним харчуванням з високим вмістом жиру, цілісністю мітохондрій та функцією міокарда. Однак трансгенні миші з різним рівнем металотіоїну недоступні, тоді як фармакологічна індукція металотіоїну з використанням цинку є досить неспецифічною або потенційно токсичною. Наше інкубування in vitro вільної жирної кислоти пальмітинової кислоти не може по-справжньому відображати метаболічні зміни, спричинені хронічним дієтичним годуванням. Через технічні труднощі ми не змогли оцінити функцію мишачих кардіоміоцитів через 24 години лікування пальмітиновою кислотою, що забезпечило б важливу інформацію для дефекту міокарда, спричиненого дієтою з високим вмістом жиру. І останнє, але не менш важливе, нещодавно було повідомлено, що ресвератрол покращує функцію мітохондрій завдяки зменшенню ацетилювання PGC-1α і, як наслідок, підвищенню активності PGC-1α (33). Однак наші результати не сприяли будь-якій ролі білка деацетилази Sirt у дієті з високим вмістом жиру і реакції, викликаної металотіоїном, вказуючи на те, що різні механізми регулювання PGC-1α можуть.

На закінчення в нашому дослідженні вперше було запропоновано докази того, що скорочувальна дисфункція міокарда, внутрішньоклітинна неправильна обробка Са 2+, накопичення АФК, пошкодження мітохондрій та втрата мітохондріальної щільності та вмісту мтДНК при ожирінні, спричиненому дієтою, мають тісну пов’язаність із зниженням регуляції коактиватор мітохондріального біогенезу PGC-1α та його ядерні фактори нижче за течією. У світлі захисту металотіоїну від індукованої серцевої дисфункції з високим вмістом жиру або пальмітинової кислоти, а також зниження регуляції головного регулятора мітохондріального біогенезу PGC-1α та його ядерних факторів нижче за течією, наші дані підтверджують нову гіпотезу про те, що з високим вмістом жиру прийом дієти (можливо, резистентність до інсуліну та діабет 2 типу) погіршує біогенез мітохондрій, що може пояснити патогенез аберантної функції міокарда при ожирінні, інсулінорезистентності та повноцінному діабеті. Обов’язково потрібно розуміти регуляцію PGC-1α та біогенезу мітохондрій при окисному стресі та антиоксидантній терапії, щоб стратегія лікування могла бути спрямована на досягнення достатньої індукції PGC-1α у терапевтично корисному вікні.