Індукована поверхнею дисоціація нековалентних білкових комплексів у мас-спектрометрі орбітрапу розширеного діапазону

Захарій Л. ВанАрнум

кафедра хімії та біохімії, Університет штату Огайо, Коламбус, штат Огайо, 43210, США.

Джошуа Д. Гілберт

кафедра хімії та біохімії, Університет штату Огайо, Коламбус, штат Огайо, 43210, США.

Михайло Євгенович Бєлов

b Thermo Fisher Scientific, Бремен, Німеччина

Олександр Олександрович Макаров

b Thermo Fisher Scientific, Бремен, Німеччина

Стеван Р. Хорнінг

b Thermo Fisher Scientific, Бремен, Німеччина

Вікі Х. Висоцький

кафедра хімії та біохімії, Університет штату Огайо, Коламбус, штат Огайо, 43210, США.

J.D.G: Thermo Fisher Scientific Inc., 5350 NE Dawson Creek Dr., Hillsboro, Oregon 97124.

Пов’язані дані

Анотація

Графічний реферат

Вступ

Поверхнево-індукована дисоціація (SID) виникла як потужний метод активації на основі зіткнення для зондування білкових складних структур у газовій фазі, що дає фрагментацію, що забезпечує інформацію, що доповнює інформацію, отриману від методів активації, згаданих раніше. 27 Замість того, щоб піддавати іони численним зіткненням низьких енергій з фоновим газом, експерименти SID направляють іони на інертну, тверду поверхню, щоб надати енергію аналіту за один високоенергетичний крок. SID, як правило, призводить до більш симетричного розподілу заряду у створених підкомплексах щодо CID 28 та UVPD. 26 Як спостерігається за допомогою приладів іонної рухливості (IM) -MS, субкомплекси, що генеруються за допомогою SID, як правило, компактні після дисоціації, перерізи зіткнень відображають біомолекулярні (суб) структури. 29 Крім того, SID зв’язаних з лігандами білкових комплексів часто призводить до субкомплексів з лігандами, що утримуються в кишені зв'язування, що часто не буває для CID. 30,31 Ці особливості роблять SID корисним інструментом для дослідження біомолекулярних комплексів без розв'язаних структур. 32–34

Донедавна робота із залученням SID білкових комплексів в основному проводилася на платформах TOF. 35,36 Зі зростанням використання нативних РС для структурної характеристики білкових комплексів стало очевидним, що часто бажано більшу роздільну здатність за масою і дозволяє глибше зрозуміти дану біологічну систему. Наприклад, вимірювання зсувів маси в результаті посттрансляційних модифікацій та/або зв'язування малих лігандів або кофакторів стає можливим на рівні білкового комплексу при достатній роздільній здатності. 37,38 Кожен тип аналізатора маси (TOF, FT-ICR, Orbitrap) має переваги та недоліки, і вибір інструменту часто залежатиме від вирішуваного питання. Нещодавно наша група продемонструвала SID на платформі FT-ICR, досягнувши неперевершеного масового дозволу підкомплексів, що генеруються SID. 39 Однак ми вважаємо, що такі методи активації, як SID, повинні бути нейтральними до постачальника та платформи, і що SID на платформах Orbitrap, оптимізованих для збільшення діапазону m/z, також буде корисним для користувачів мас-спектрометрії.

Експериментальна секція

Дизайн пристрою SID

(а) Технічне креслення пристрою SID з кріпильними кронштейнами. (b) Спрощене зображення поперечного перерізу пристрою SID, що показує траєкторію руху іонів справа наліво в режимі SID. (c) Схема модифікованої платформи EMR з прототипом SID-пристрою, встановленого між квадруполем і C-пасткою.

Виготовлення пристрою проводилося власноруч машинним цехом кафедри хімії та біохімії ОСУ, використовуючи алюміній для всіх електродів та полімерний ефір-ефір-кетон (PEEK) для монтажу та належного розміщення електродів. Початковий шлях іонів залишається безперешкодним, щоб забезпечити мінімальний вплив лише на експерименти MS (тобто без активації), а також експерименти CID (HCD). Коли потрібен SID, фронтальні електроди SID-пристрою налаштовуються на те, щоб спрямовувати іони на поверхню у верхній частині пристрою. Детальний опис поверхні, яка використовується для зіткнень, можна знайти деінде. 35 Коротко кажучи, поверхня скла була покрита шаром титану 10 Å, шаром золота 1000 Å, а згодом модифікована моношаром, що самостійно зібраний із фторуглероду. Детальні креслення та напруги, що подаються на пристрій SID, можна знайти на рисунку S1.

Мас-спектрометрія

Матеріали

Результати і обговорення

Стрептавідин

Стрептавідин служить модельною системою для експериментів з СІД. Це симетричний гомотетрамер D2 на 53 кДа, що складається з субодиниць, розташованих як димер димерів (рис. 2а). Після активації CID тетрамер стрептавідину дисоціює на сильно заряджені мономери та відносно низько заряджені тримери (рис. S3). 44 Така поведінка, коли одна субодиниця розгортається і бере із собою непропорційно велику кількість заряду, характерна для ІД через його багатоступеневий процес енергетичного осадження. 16–18 Важливо, що цей результат дисоціації від CID не підтримує відомий димер розташування субодиниць димерів. На відміну від цього, попередня робота показала, що СІД тетрамеру стрептавідину призводить до утворення димерів при низькій енергії та мономерів при високій енергії, що відповідає площам розділу та складній геометрії, що визначається кристалічною структурою. 30

(а) Зони інтерфейсу тетрамеру стрептавідину, як визначено за допомогою аналізу PISA (1SWB). 58 (b) Мас-спектр тетрамеру стрептавідину в умовах зниження заряду. (c) Спектр SID (45 В, 495 еВ) тетрамера 11+. (d) Збільшений сегмент (c) при налаштуванні роздільної здатності 140 000, що виявляє розподіл ізотопів 3+ мономерів та 6+ гомодимерів. (e) Збільшений сегмент (c) з налаштуванням роздільної здатності 17 500, показуючи нерозщеплені N-кінцеві аддукти метіоніну (ів) та натрію на 3+ мономері та 6+ димерах.

Вплив температури на джерело іонів

Великий наголос у нативних РС лежить на збереженні фізіологічної структури/структурних особливостей білків та білкових комплексів під час аналізу за допомогою щадних інструментальних умов для іонізації, переносу і виявлення іонів. На жаль, внаслідок таких щадних умов роботи приладів природні іони мають підвищену тенденцію переносити аддукти з нелетких солей та буферів. Надмірне наведення часто зменшує "видиму роздільну здатність" приладу набагато нижче того, що можна досягти в умовах денатурації. 48 Область джерела на лінії приладів Exactive часто утримується при відносно високій температурі (200–250 ° C) для поліпшення чутливості та знешкодження іонів, коли вони потрапляють у мас-спектрометр. Хоча це різко покращує видиму роздільну здатність та чутливість приладу, часто викликає занепокоєння той факт, що високі температури джерела можуть призвести до реструктуризації іонів, 49 подібно до того, що спостерігалося при низьких енергіях дисоціації, спричинених зіткненнями. 50 Тут ми використовуємо SID для спроби визначити, чи впливають високі температури джерела іонів на структуру іонів білкового комплексу.

У попередніх дослідженнях було показано, що SID диференціює природні іони та іони, що зазнали грубих структурних змін (тобто колапсу, розширення) шляхом попередньої активації іонів-попередників до дисоціації. 51 Помітні відмінності у фрагментації SID спостерігались, коли іони попередників активувались перед SID у порівнянні з фрагментацією без попередньої активації. Така ж чутливість до попередньої активації спостерігається і у нового пристрою SID у платформі Q-Exactive EMR, як і очікувалося - SID вимірює систему в тому вигляді, в якому вона представлена, забезпечуючи моделі дисоціації, які змінюються залежно від ступеня попередньої активації.

Графіки порівняння відносного ступеня утримання біотину на (а) тетрамери стрептавідину як функція температури джерела іонів, (b) димери, вироблені SID (30 В, 330 еВ) тетрамерів стрептавідину, показаних у частині (а), як функція температури джерела іонів, і (c) димери, одержувані з СІД тетрамеру стрептавідин-біотин, як функція напруги прискорення СІД при постійній температурі джерела іонів 120 ° С. У всіх випадках стовпчики помилок є репрезентативними для стандартного відхилення триразових вимірювань.

L-глутаматдегідрогеназа

Бичача глутаматдегідрогеназа (GDH) - це гомогексамерний фермент 333,6 кДа, який розміщений у складеному димері тримерів із спіральною антеною, що виступає та стабілізує кожен тример. Попередні дослідження показали, що GDH важко дисоціювати в газовій фазі CID, часто вимагаючи високих енергій CID та високих зарядних станів попередника, що призводить до викиду розгорнутого мономеру, який не є репрезентативним для початкової схеми субодиниці. 42,57 На відміну від цього, раніше було показано, що SID гексамера GDH на платформі Q-IM-TOF в основному призвів до дисоціації гексамера GDH на тримери з вторинною дисоціацією на мономери. 42 Крім того, Ma et al. показали, що в умовах зниження заряду (додавання TEAA) тримери та мономери, отримані з SID гексамеру GDH, залишаються компактними та мають перерізи зіткнень, подібні до тих, що очікуються для природних субкомплексів GDH, відсічених від кристалічної структури гексамера. Ці результати показують, що на відміну від CID, SID може бути використаний для з'ясування топології гексамера GDH.

Спектр SID гексамеру +28 GDH при (а) 175 В і (b) Напруга прискорення 235 В SID, що призводить до тримерів та мономерів, які вказують на загальний димер розташування тримерів гексамера GDH.

Висновки

Додатковий матеріал

Подяка

Фінансування: Автори вдячні за фінансову підтримку Національного наукового фонду (NSF 1455654 В.Х.В.) та Національного інституту охорони здоров'я (NIH P41GM128577 В.Х.В.).

Автори висловлюють подяку пану Ларрі Анталу (відділ хімії та біохімії OSU), пану Еріку Джексону (група підтримки приладів хімії та біохімії OSU) за допомогу у виробництві пристроїв SID та проектуванні схем комутації; Марія Рейнхардт-Шиба, Дмитро Болл, Олександр Холомеєв, Ян-Пітер Хаушильд, Євген Дамок (Thermo Fisher Scientific) за допомогу та корисні дискусії щодо модифікацій приладів; Ренді Педдер (Ardara Technologies) за корисні обговорення та підтримку електроніки; Ройстон Квінтін та Ліндсей Моррісон для початкових експериментів SID на платформі Orbitrap з іншим дизайном; Маршалл Берн (Protein Metrics Inc.) за допомогу у спектральній деконволюції та відносному вимірюванні; та Джейкоб Маккейб (Техаський університет A&M) та Бенджамін Джонс (Університет штату Огайо) за допомогу в пакетній обробці середніх розрахунків стану заряду.

Виноски

Додаткова інформація: Детальні креслення пристрою SID та напруги. Схема схеми комутації зовнішнього джерела живлення. Спектри стрептавідину та GDH лише для MS та CID. Спектри стрептавідину, отримані протягом ряду енергій СІД. Спектри біотину, зв’язаного з тетрамером стрептавідину до SID, та димери після SID. Порівняння зв’язування біотину з димером стрептавідину в залежності від температури джерела іонів та енергії СІД. CID стрептавідин-біотиновий тетрамер. Середні значення стану заряду для димерів стрептавідин-біотин.