Межі у фармакології

Етнофармакологія

Редаговано
Джордж К. Лі

Західно-Сіднейський університет, Австралія

Переглянуто
Шуай Джи

Медичний університет Сюйчжоу, Китай

Суреш К. Моханкумар

JSS Pharmacy College, Індія

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

метаболічний

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 кафедра традиційної китайської медицини, лікарня Пекінського союзу медичного коледжу, Медичний коледж Пекінського союзу, Китайська академія медичних наук, Пекін, Китай
  • 2 Медичний дослідницький центр, лікарня Пекінського союзу медичного коледжу, Медичний коледж Пекінського союзу, Китайська академія медичних наук, Пекін, Китай

Відвар Jin-Mai-Tong (JMT) - традиційний китайський складний рецепт для лікування діабетичної периферичної нейропатії (ДПН). Метою цього дослідження є дослідити нейропротекторну дію відвару JMT на діабетичних щурів з периферичною нейропатією та з'ясувати потенційний механізм, заснований на підході метаболоміки. Щурів Sprague-Dawley (SD) випадковим чином розподіляли на чотири групи: контрольну групу, модельну групу, спричинену стрептозотоцином (STZ), групу, яка отримувала JMT з низькими дозами (JMT-L), та групу, яка отримувала високі дози JMT (JMT-H). Після 12 тижнів лікування оцінювали поведінкові зміни, невелику втрату клітковини та гістопатологічні пошкодження сідничного нерва. Зразки сироватки збирали для нецільового аналізу метаболоміки на основі UPLC/QTOF-MS та багатовимірної статистики. Як результат, лікування JMT у двох дозах (13,9 та 27,8 г/кг⋅д), очевидно, покращило механічний поріг болю (P 1. Номер партії та інша детальна інформація щодо кожного лікарського засобу були наведені в додатковій таблиці S1 та на додатковій малюнку S1. Зразки ваучерів були здані на зберігання у відділ традиційної китайської медицини лікарні Пекінського союзу медичного коледжу, Пекін, Китай.

Для приготування відвару JMT змішані неочищені препарати замочували стильованою водою кімнатної температури (25 ° C) на 2 години. Для першого відвару ліки кип'ятили із зворотним холодильником у 10-кратному розмірі води (1:10, w/v) протягом 1,5 год перед фільтруванням. Для другого відвару залишки ліків кип'ятили із зворотним холодильником у восьмикратному обсязі води (1: 8, w/v) перед фільтруванням. Потім два відвари змішували між собою та концентрували у вакуумі. Концентрований відвар сушили ліофілізацією з виходом екстракції 19%. Потім екстракт JMT зберігали при -80 ° C і добре суспендували у воді перед використанням.

Хімічний аналіз відвару JMT

Тварини та лікування

Щурам групи STZ + JMT-L та групи STZ + JMT-H перорально вводили відвар JMT у дозі 13,9 г/кг (що дорівнює клінічній дозі, розрахованій за масою сирих препаратів) та 27,8 г/кг, відповідно, один раз на день і протягом 12 тижнів поспіль після встановлення моделі діабету. Щурам у групі STZ та контрольній групі вводили однаковий обсяг дистильованої води (5 мл) один раз на день. Вагу тіла та рівень глюкози в крові кінчика хвоста у всіх щурів вимірювали кожні 4 тижні.

Фон Фрей Сенсорне тестування

Після 12 тижнів лікування оцінювали механічну чутливість до шкідливих подразників за допомогою естезіометра приладу вимірювання болю фон Фрея (IITC Life Science Inc., Woodland Hills, CA, США) (Choi et al., 2014; Yerra et al., 2018). Як було описано раніше, після того, як щури адаптували навколишнє середовище, задня лапа стимулювалася зондом інструменту Фон Фрея (Song et al., 2019). Механічний больовий поріг вимірювали як силу, при якій спостерігали відведення лапи і реєстрували в грамах. Кожного щура вимірювали 3 рази на двосторонніх задніх лапах з інтервалом у 5 хвилин між послідовними подразниками. Механічний больовий поріг щурів розглядався як середнє вимірювання.

Спостереження за морфологічними змінами в сідничному нерві

В кінці експерименту всіх щурів жертвували внутрішньочеревно ін'єкцією 10% хлоралгідрату (3 мл/кг) для глибокої анестезії. Після забору крові лівий сідничний нерв (2–3 мм) був виділений та зафіксований у 4% параформальдегіді (PFA) при 4 ° C протягом ночі. Сідничний нерв був вбудований у парафін і вирізав як поперечний, так і поздовжній розріз (4 мкм). Звичайна гістопатологічна процедура проводилася для фарбування гематоксиліну та еозину (H&E) для спостереження за патологічними структурними змінами, а зображення були отримані Aperio CS2 (Leica Biosystems, Річмонд, Іллінойс, США).

Внутрішньоепідермальний та субепідермальний нервовий профіль

Приготування зразка сироватки

В кінці експерименту всіх щурів голодували протягом 12 год (вільно пити воду), а потім жертвували для збору сироватки під наркозом. Кров відбирали з черевної аорти. Кожен зразок витримували при 4 ° С протягом 4 год, центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв, і супернатант збирали і зберігали при -80 ° С до метаболічного аналізу. Перед аналізом кожен зразок сироватки розморожували при 4 ° С, а аликвоту по 100 мкл переносили в стерильну силіконізовану пробірку Еппендорфа об'ємом 1,5 мл. Після обробки 300 мкл холодного метанолу суміш вирвали протягом 30 с, а потім витримували при 4 ° С протягом 1 год для осадження білка. Після центрифугування при 13000 g протягом 10 хв супернатант потім збирали та фільтрували через мембрану 0,22 мкм перед аналізом UPLC/Q-TOF MS. Зразок контролю якості (QC) готували шляхом змішування рівного обсягу (50 мкл) кожного тестового зразка. Зразок QC вводили 6 разів на початку циклу, щоб забезпечити рівновагу системи UPLC/Q-TOF MS, а потім між кожними 6 зразками серед циклу, щоб забезпечити узгодженість аналізу.

Умови UPLC/QTOF-MS

Обробка даних та статистичний аналіз

Препроцесія необроблених даних та багатовимірний аналіз для дослідження метаболоміки проводили за допомогою MetaboAnalyst 4.0 2. Після запрограмованої обробки отримані тривимірні матриці даних містили опис зразка, нормалізовані площі піків та пари часу утримання-m/z для подальшого багатовимірного аналізу. Для відображення загальних відмінностей був використаний аналіз основних компонентів (PCA). Частковий аналіз дискримінації з найменшим квадратом (PLSDA) та ортогональна проекція на прихований структурно-дискримінаційний аналіз (OPLS-DA) використовувались для перевірки моделі та вивчення різних метаболітів між групами. Метаболіти, відібрані як кандидати на біомаркери для подальшого статистичного аналізу, були ідентифіковані на основі змінної важливості в проекції (VIP) ≥ 1 із 10-кратної перехресно перевіреної моделі OPLS-DA, яка була перевірена на одновимірному рівні з коригуванням P 3 (Wishart et al., 2018), база даних KEGG 4 (Kanehisa and Goto, 2000) та METLIN (Sud et al., 2007). Похибка маси становила 10 ppm для MS 1 і 15 ppm для MS 2. MetaboAnalyst 4.0 був використаний для аналізу метаболічних шляхів на базі даних KEGG (Smith et al., 2005).

Результати і обговорення

Вплив відвару JMT на глюкозу крові, втрату маси тіла та механічний поріг болю щурів DPN

Лікування декоктоїном JMT як у високих, так і в низьких дозах не впливало на масу тіла діабетичних щурів, індукованих STZ (Рисунок 1А, P > 0,05). Як показано на малюнку 1B, після лікування 12 тижнів у діабетичних щурів, які отримували відвар JMT у високих дозах, рівень глюкози в крові був нижчим, ніж у нелікованих діабетичних щурів (P 0,05). Незначне зниження рівня глюкози в крові свідчить про потенційний гіпоглікемічний ефект відвару JMT. Однак регуляція метаболізму глюкози була незначною, оскільки рівень глюкози в крові діабетичних щурів, які отримували JMT-H, був набагато вищим, ніж здорові нормальні щури. Крім того, в цьому дослідженні на тварині використовували модель діабетичних щурів типу 1, індуковану STZ-ін’єкцією, яка має абсолютний дефіцит інсуліну, тому потенційний гіпоглікемічний ефект відвару JMT, який спостерігається тут, може бути недостатнім, щоб продемонструвати його клінічне значення. Для подальшого вивчення гіпоглікемічного ефекту відвару JMT та отримання більшої кількості доказів клінічної практики буде проведено більше експериментів на моделі тварин із діабетом другого типу та найму найближчим часом хворих на цукровий діабет.

Фігура 1. Вплив 1шт JMT на масу тіла (A), глюкоза в крові (B), і фон Фрей сенсорне тестування (C). Дані є середнім для групи ± SEM (n = 6 на групу). ## P 0,05).

Відвар JMT покращив патоморфологічні зміни сідничного нерва у щурів DPN

Малюнок 2. Гістологічне дослідження сідничного нерва в поперечному перерізі (A – D) і поздовжній (E – H) вид. Звичайні мієлінізовані волокна сідничного нерва були розташовані щільно і обгорнуті мієліном (жовті стрілки). Сідничні нерви щурів DPN демонстрували очевидні вакуолярно-подібні дефекти (сині стрілки), зміни демієлінізації та усадку аксонів (зелені стрілки). Збільшення: 40 ×, шкали шкали: 20 мкм (поперечний переріз) та 50 мкм (поздовжній переріз).

Малюнок 3. Нервові профілі шкіри стопи, виявлені за допомогою імунофлюоресцентного аналізу. (A – D) Репрезентативні зображення імунофлуоресцентного фарбування підошовних шкір задньої лапи. Жовті стрілки вказують на PGP 9,5 імунореактивне внутрішньоепідермальне нервове волокно (IENF), а червоні стрілки вказують на субепідермальне нервове волокно (SNF). Збільшення: 20 ×, шкали шкали: 100 мкм; (E) ВЯП (волокна/мм); (F) IENFD (волокна/мм). Дані є середнім для групи ± SEM (n = 3 на групу). *P # P ## P 0,05).

Аналіз метаболоміки

Гарантія якості

Для оцінки повторюваності встановленого методу п'ять екстрагованих іонів у режимі позитивних іонів (0.73_407.9660, 4.16_503.2578, 8.54_255.2217, 12.11_889.9594 та 16.20_743.5491, показані у вигляді часу утримання_м/z) та п'ять екстрагованих іонів у режимі негативних іонів (0.55_143.0938, 4.76_671.2985, 8.53_301.2971, 12.75_629.8071 та 16.89_955.4596) були відібрані з зразків контролю якості (QC) протягом усього експерименту . Оцінювали точність площі піків десяти іонів. Як показано в додатковій таблиці S3, коефіцієнти динаміки площі піку 10 вибраних іонів становили 2,53–11,29%, що свідчить про хорошу точність системи UPLC/QTOF-MS. Крім того, кореляційний аналіз зразків контролю якості також показав задовільну стабільність системи з Р. 2 ≥ 0,977 та 0,963 у позитивному та негативному режимі, відповідно (додатковий малюнок S3). Результат показав, що підхід метаболоміки був повторюваним і стабільним для наступних досліджень.

Багатовимірний статистичний аналіз

Малюнок 4. Дискримінація метаболічного профілю сироватки серед щурів Control (CON), STZ, STZ + JMT-H, STZ + JMT-L. (А1, А2) Діаграми балів PCA в режимах негативного та позитивного іонів відповідно. (B1, B2) Діаграми оцінки PLS-DA в режимах негативного та позитивного іонів відповідно, n = 6 на групу.

Екран та ідентифікація потенційних біомаркерів

Ортогональний частковий дискримінантний аналіз найменших квадратів (OPLS-DA) був проведений для виявлення суттєво змінених іонів між контрольною та STZ групами, групами STZ та STZ + JMT-H, а також групами STZ та STZ + JMT-L. Моделі OPLS-DA були розроблені на основі максимізованих міжгрупових відмінностей та мінімізованих внутрішньогрупових відмінностей, і продемонстрували прийнятні можливості для прогнозування та надійності з Р. 2 Y ≥ 0,89 і Питання 2 ≥ 0,44 (рисунок 5). Тоді було сформовано змінну важливість у проекційних (VIP) ділянках. У цьому дослідженні змінний іон зі значенням VIP> 1 і P 1 в OPLS-DA та P Ключові слова: діабетична периферична нейропатія, традиційна китайська медицина, відвар Цзінь-Май-Тонг, метаболоміка, діабет

Цитування: Zhang Q, Song W, Liang X, Xie J, Shi Y, Shi X, Qiu B and Chen X (2020) Метаболічний погляд на нейропротекторний ефект відвару Цзінь-Май-Тонг (JMT) на діабетичних щурів з периферією Нейропатія з використанням нецільової стратегії метаболоміки. Спереду. Фармакол. 11: 221. doi: 10.3389/fphar.2020.00221

Отримано: 18 листопада 2019 р .; Прийнято: 18 лютого 2020 р .;
Опубліковано: 05 березня 2020 р.

Джордж Цянь Лі, Західно-Сіднейський університет, Австралія

Шуай Цзи, медичний університет Сюйчжоу, Китай
Суреш Кумар Моханкумар, Фармацевтичний коледж JSS, Індія

† Ці автори зробили однаковий внесок у цю роботу